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germline deletionとfloxedアリルのバンド トピック削除
No.9403-TOPIC - 2020/12/31 (木) 06:13:49 - 大晦日の朝
雑談的なことで申し訳ありません。

私はあるfloxedマウスの組織特異的な働きを解析する目的で、あるCreマウスと掛け合わせ、さらにmTmGマウスとも掛け合わせたマウスを作製しました。Creが発現する組織ではfloxed遺伝子はノックアウトとなり、更にGFPが陽性になります。

ところが本来Creを発現しない組織にも関わらずGFPの発現が認められたため、germ line deletionを疑いました。すると私が使用しているCreマウスは、不本意なgermline deletionを頻繁に起こしうるCre knockinマウスだとわかりました。結果的に全ての組織でGFPが認められました。

頻発すると報告されてる以上、今回のことは起きてもおかしくないのですが、一つ腑に落ちない現象があります。それは、floxed遺伝子のgenotyping PCRを行った際、floxedとwild-typeの2本のバンドを持つ、ヘテロのマウスを今回用いました。ただ、全組織がGFPであるならば、floxed遺伝子はnullになるため、floxedのバンドは出るはずはなく、wild-typeのみのバンドが出るべきではなかったのではないかと？と考えております。

考え方に誤りがあればご指導いただきたいです。

宜しくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.9403-3 - 2020/12/31 (木) 11:30:47 - 大晦日の朝
TK-1様

いつもTK-1様のコメントを読んで勉強させていただいていたので、コメントをいただけて大変嬉しく思います。
確かにランダムインサーションでは感覚的に厳密なCreの発現は期待できなさそうです。

：あとは全てのflox alleleのdeletion efficiency が同じとは限りません。

というのはfloxed geneとfloxed mTmGのrecombination効率が異なる、ということでしょうか。
なるほど、それでしたら私がfloxedのバンドをPCRで認めた説明が付きますね。

：GFPが見られたのは全ての組織であって、全ての細胞でGFPがでましたか？　組織レベルでモザイクになっていればfloxのバンドはでますしGFPも出るんじゃないですか。

全てかどうかはわかりません。
このCreは血球細胞では発現していないはずですが、germ line deletionを疑った際に血液のスメアを作製してGFPを見れば確定できるのではないかと考え、採血し、蛍光顕微鏡で血液スメアを見たところ、（全て稼働かはわかりませんが）多くの細胞でGFPが発現していました。


恥ずかしながら、私はこれからマウスを使った研究を行い始める予定で、germ line deletionなどという用語も聞いたことがなく、それを調べた際には非常に複雑なメカニズムで、それが自分のマウスで生じてしまったことに精神的な疲労感を持ちました。このようなgerm line deletionを頻発するCreマウスというのは多いのでしょうか？あるいは、どのようなCreでも常にgerm line deletionの可能性は大なり小なりあるので必ず疑ってかかるもしくは確認（nullを判定するためのPCRなど)するというのを常識として持ち合わせておくべきでしょうか？

詳しい方からのコメントをいただけて本当に助かりました。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.9403-2 - 2020/12/31 (木) 10:31:07 - TK-1
よくあることです。特にCreがノック員でなくランダムインサーションでで作られているものではおおいです、モザイクになることも多いです。

あとは全てのflox alleleのdeletion efficiency が同じとは限りません。

GFPが見られたのは全ての組織であって、全ての細胞でGFPがでましたか？　組織レベルでモザイクになっていればfloxのバンドはでますしGFPも出るんじゃないですか。

germline deletionとfloxedアリルのバンド 削除/引用
No.9403-1 - 2020/12/31 (木) 06:13:49 - 大晦日の朝
雑談的なことで申し訳ありません。

私はあるfloxedマウスの組織特異的な働きを解析する目的で、あるCreマウスと掛け合わせ、さらにmTmGマウスとも掛け合わせたマウスを作製しました。Creが発現する組織ではfloxed遺伝子はノックアウトとなり、更にGFPが陽性になります。

ところが本来Creを発現しない組織にも関わらずGFPの発現が認められたため、germ line deletionを疑いました。すると私が使用しているCreマウスは、不本意なgermline deletionを頻繁に起こしうるCre knockinマウスだとわかりました。結果的に全ての組織でGFPが認められました。

頻発すると報告されてる以上、今回のことは起きてもおかしくないのですが、一つ腑に落ちない現象があります。それは、floxed遺伝子のgenotyping PCRを行った際、floxedとwild-typeの2本のバンドを持つ、ヘテロのマウスを今回用いました。ただ、全組織がGFPであるならば、floxed遺伝子はnullになるため、floxedのバンドは出るはずはなく、wild-typeのみのバンドが出るべきではなかったのではないかと？と考えております。

考え方に誤りがあればご指導いただきたいです。

宜しくお願いします。
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