全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.940-15 - 2012/09/21 (金) 03:55:43 - おお 終始こどんについてはつける方が安全かと思います。つけなくても止まるようにベクターが設計してあるわけですけど。。。そうすると制限酵素で張り付けるだけで作業がすむ場合もありますから。いろいろなミューテーションなどいれて比較なら、余分な配列は横並びで比較はできなくもないですが、気持ち悪くないですか?じゃあタグだって余分な配列だといわれれば強くは反論できませんけどね。

(無題) 削除/引用 No.940-14 - 2012/09/21 (金) 03:48:20 - おお > (1) ドメインの長さ (両端のアミノ酸の正確な位置) を知りたい場合、Uniprot以外で参考になる情報はありますでしょうか? Uniprotのドメインの長さと、論文から調べたドメインの長さが違うので、正確な情報を知りたいです。 > 何をもって正確とするかと考えると、その何にあたるものが漠然としていることが大抵なのでは?ドメインの定義は構造単位という場合もあるかと思いますが、機能を考える時その構造から伸びるランダムコイルの部分は重要じゃないかどうかとかもあるでしょうし。構造単位と考えた時、あなたのタンパクの構造が解けていなければほかの解けている構造からの推測だけで正確な情報ではないでしょうし、構造から来たものじゃなくホモロジーから来たものであれば構造のスペキュレーションはあるにしても、構造は分かっていないわけですし。 機能にともなうタンパク複合体として構造がわかっている(たぶんそうどう性のあるものの構造がわかっている)ものであれば、それを元にどうするか考察することは可能かもしれません。

終止コドン 削除/引用 No.940-13 - 2012/09/20 (木) 14:07:25 - mon ドメインの端は、皆さんと同様ですね。悩むところです。 さて、終止コドンについて、動物細胞についてはどれも差がないようですが、大腸菌ではTGA=TAA>TAGの順に翻訳終結しやすいようです。古い論文があったのですが....。 大腸菌での大量発現ベクターには、TGATAAなど２重にしているものもありますね。 TAGコドンはsupE変異を有したクローニング用大腸菌ではグルタミンに翻訳されることがあるので注意してください（効率は100%ではなく前後の塩基配列に影響されます、<20%らしい）。 なので、TGA・TAAを使うことが私は多いです。

(無題) 削除/引用 No.940-11 - 2012/09/20 (木) 01:53:37 - おお >何を持って「正確」 そうですね、ドメイン最小単位を見つけるのであれば両端の余分なところはいらないか、後々削っていくかということになるかもしれません。そのドメインだけを取り出して実験している論文があればどこまで含めば機能するか分かるかもしれませんね。 わたしが、構造などを参照し隣の構造をとる部分の直前まで引っ張るのは、構造を取ってないところも機能に関与してる可能性を考慮しているのも理由です。

(無題) 削除/引用 No.940-10 - 2012/09/19 (水) 23:24:41 - 直輝 (1)私はPHドメインやSHドメインには詳しくありませんが、何を持って「正確」と判断するのか、その基準が自分の中になければ「正確」な答えは出ない気がします。 論文によって、ドメインの端が数アミノ酸違うのはよくあることです。 今お持ちの論文とUniprotのリファレンスと少なくとも２つは文献があることですし、あとは下におおさんやmonさんが詳しく書いてくださったようなやり方を試して、総合的に判断することになりそうですね。 ひとつ付け加えるなら、自分はヒトとマウスの配列を比べてドメインの端を考えるのもよくやります。 私はUniprotで間に合っているので、それ以外のデータベースはわかりません。 念のためですが、論文に書いてあることが正しいと限らないように、データベースにも間違いは多々あります。とはいえ、Uniprotはよくキュレートされていると思います。 論文がたくさん集まったら、多数決で決めちゃっても多分OKだと思いますが… (2)インサートとベクターの終止コドンの間に余分な配列がないなら、ベクターの終止コドンだけで問題ないと思います。 クローニングサイトとか余分な配列がある場合には、自分で終止コドンを入れなければなりません。 終止コドンの種類もお好みで良いと思いますけどね。 プライマー設計上の問題（局所的なAGCTのバランス、２次構造、プライマーダイマー、制限酵素サイト出現など）を気にするぐらいかな。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.940-8 - 2012/09/19 (水) 17:46:34 - 初心者 重ねて質問がございます。 (1) ドメインの長さ (両端のアミノ酸の正確な位置) を知りたい場合、Uniprot以外で参考になる情報はありますでしょうか? Uniprotのドメインの長さと、論文から調べたドメインの長さが違うので、正確な情報を知りたいです。 (2) C末端に位置しないドメインのコンストラクトを作製する場合、終止コドンを新たに付加すべきでしょうか (ベクターには終止コドンがあります。) ? また、付加する場合は、TAA、TAG、TGAのどの終止コドンを選択するのが適当でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.940-5 - 2012/09/18 (火) 14:16:10 - おお >alpha-helix, beta-sheet構造などを複数サイトで予測して、高次構造が予測されない(ドメインを繋ぐリンカーとなり得る）アミノ酸配列を見いだします。 あ、これ私もやります。。。中途半端な説明になってしまっていました。

(無題) 削除/引用 No.940-4 - 2012/09/18 (火) 12:58:32 - mon おおさんの手法も確実な安全策でよいと思います。 できるだけ小さくしたい時や隣の（機能・構造類似性が明らかになっている）ドメインが離れているときは、alpha-helix, beta-sheet構造などを複数サイトで予測して、高次構造が予測されない(ドメインを繋ぐリンカーとなり得る）アミノ酸配列を見いだします。そのなかで、Gly,Ser,Proなど高次構造を破壊しやすいアミノ酸を選んで、それを含めた配列を選択するのも手だと思います。 長いフレキシブルな配列（alpha-helix, beta-sheet構造などを取らない）もタンパク認識に関与することもあるので、無用に長いフレキシブル配列を含めるのも気を付けましょう。明確な根拠はありませんが、「自分」の目安は10アミノ酸なら大丈夫(相互作用しにくい）だけど、実際には5アミノ酸くらいを採用かな。 phage-display法では7~12アミノ酸長でKdがuMオーダーのpeptideが取れますので、フレキシブル配列の特定のアミノ酸の種類(荷電性、疎水性）の含有量が多い場合は注意しましょう。Gly,Ser,Pro, (Ala)はタンパク相互作用に関与する可能性は低いです。 最近は高次構造が決定されているタンパクも多いので、それらの配列と高次構造を参考にしましょう。例えば、参考にしたドメインのC末がalpha-helixを取るなら、ご自分のドメインのC末が参考ドメインより長くなっても、alpha-helixを取りそうな連続するアミノ酸は含めるとか。 ただし、上記はあくまでも参考と思ってください（どんどん優秀な予測プログラムが出てきていますし）。事実、毎回悩みます。

(無題) 削除/引用 No.940-3 - 2012/09/18 (火) 00:17:25 - おお わたしなら、隣のドメインの手前か若干オーバーラップするところまで引っ張りますけど。

(無題) 削除/引用 No.940-2 - 2012/09/17 (月) 20:30:44 - 直輝 一番簡単なのは、Uniprotというサイトで検索して、Sequence annotation という項目を見れば書いてあると思います。

タンパク質のドメインのコンストラクトの作製 削除/引用 No.940-1 - 2012/09/17 (月) 19:58:46 - 初心者 あるタンパク質のドメイン (PH ドメイン、SH3ドメインなど) のコンストラクトをつくる予定です。ドメインの長さ (両端のアミノ酸の位置) はどのように決められていますか？論文で調べても、ドメインの長さがまちまちで、どのような情報から両端のアミノ酸の位置を決定しているのかよく分かりません。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---