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(無題) 削除/引用 No.9399-21 - 2021/07/18 (日) 04:42:19 - bh 同一メーカー同一型番の抗体でもしばしばlot差が大きいというか、実際ありすぎの抗体があります。論文とか学会使ってうまくいってる人を探して、メーカーだけでなくlot 番号も聞いた方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.9399-20 - 2021/07/16 (金) 16:20:35 - まあ 以前、M2買いなおしたところ今まで検出できていたものが全く検出できなくなったことがありました。シグマにも問い合わせたんですが、世界的にもそういう報告は無いので原因不明としか返答がありませんでした。 和光で売っている抗DYKDDDDKタグモノクローナル抗体（クローン1E6）を試しに使ってみると検出できるようになったので、以後これを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.9399-19 - 2021/07/16 (金) 14:50:01 - TOK > 2H8はM2と比べてみましたが、謳っているほど優れておらず、むしろM2の方がよかったです。 古いトピに新しくレスが付いたタイミングで、ちょうど私も2H8を使ってみました。ただし、使用方法はWBではなくFACS染色です。とあるGPCRのN末にFLAGを付加し、surfaceに発現しているかどうかを確認するというものです。これは2H8開発者がやったことと似ていますね。 今までもこのような染色はいろいろやっていまして、クローンL5やFLA1で問題なくできていました。しかし、今回のGPCRに対してはL5やFLA1ではほとんど染まらず、細胞表面にはトランスポートされていないのかなと思われました。それでも念のため2H8を購入し、これで染めてみたところ明るく染まりました。あやうく間違った結論を出すところでした。 おそらく、FLAG配列の一部がこのGPCRの立体構造に埋まっていて、2H8だけが認識できるエピトープが出ていたということなのでしょう。 やはり、使用方法・ターゲット分子の構造によって、このクローンがいい、あれは悪いというのはケースバイケースになるのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9399-18 - 2021/07/16 (金) 09:01:37 - が 2H8はM2と比べてみましたが、謳っているほど優れておらず、むしろM2の方がよかったです。 >> COIさん 情報ありがとうございます。 お使いになられたことはありますか？ これほどM2との違いがあればもっと広まっている気がするのですが、今まで聞いたことがなかったので、興味があります。 >[Re:7] COIさんは書きました : > https://www.transgenic.co.jp/products/antibodies-product/transgenic/detail/KO602-S.html > > http://plaza.umin.ac.jp/j_bio/2h8.html

Origeneの抗体 削除/引用 No.9399-17 - 2021/07/15 (木) 23:39:41 - PPI > TOKさん OrigeneのClone OTI4C5使ってみたのですが、 カタログにはN末のFLAGtagは認識しない と書いてあるんですが、N末しか認識しないんでしょうか？ N末とC末のtagで同じproteinでやってみたのですが、 N末のほうしかうまくいきませんでした。

(無題) 削除/引用 No.9399-16 - 2021/01/02 (土) 08:57:12 - TOK > 昨日L5を購入しましたので、まずはそれを試してみます。 L5はrat IgGですので二次抗体にお気を付けください。念のため。

(無題) 削除/引用 No.9399-15 - 2021/01/01 (金) 01:09:24 - kent TOKさん、 さらなる情報ありがとうございます。 今までM2とのほかにFG4Rというのも使っていましたが、いまいちでした。 またGenescriptからの抗体もダメでした。 rabbitのpolyclonalは検出はいいのですが、バックが高くて困っていました。 昨日L5を購入しましたので、まずはそれを試してみます。 ご助言ありがとうございます。 >[Re:13] TOKさんは書きました : > > L5の情報、ありがとうございます。試されたことはありますか？ > いくつかのタグ付きタンパクに対し手持ちのクローンを個々に適当に試した結果、L5の心証がよかったという感じでちゃんとした比較データはないです。 > 代わりに先の引用とは別会社からのL5データで貼っときます。 > www.novusbio.com/products/dykddddk-epitope-tag-antibody-l5_nbp1-06712 > > あと、Clone FLA-1もよかった記憶が。M2はFLAG開発したSigmaのものだけど、後発抗体もいろいろいいのあるということだね。

(無題) 削除/引用 No.9399-14 - 2021/01/01 (金) 01:07:07 - kent おおさん、 抗体で対処できるならそれが早くて簡単かなと思っていますが、抗体でそれほど改良できないようでしたらぜひ試してみます。 ありがとうございます。 >[Re:11] おおさんは書きました : > >[Re:6] 　vbんjkmさんは書きました : > > > 分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの３段階でもかなりいい感じに濃縮できる。 > > 一度やる価値があるとおもいます。ただ組織であまりLysateを作るとき見ないのでちょっと躊躇していました。 > たとえば等張でもしっかりホモジナイズするとミトコンドリアが単離できますし、細胞質にある可溶性蛋白であれば、弱いデタージェントでしっかりホモジナイズすれば溶出してきて、あまり繊維状の成分などを可溶化しない状況で細胞内の蛋白が溶出できるのではないかと思ってます。組織なそれなりのホモジナイズ（物理的分散）が必要なので、そこだけ注意したほうがいいでしょう。 >

(無題) 削除/引用 No.9399-13 - 2020/12/31 (木) 20:28:21 - TOK > L5の情報、ありがとうございます。試されたことはありますか？ いくつかのタグ付きタンパクに対し手持ちのクローンを個々に適当に試した結果、L5の心証がよかったという感じでちゃんとした比較データはないです。 代わりに先の引用とは別会社からのL5データで貼っときます。 www.novusbio.com/products/dykddddk-epitope-tag-antibody-l5_nbp1-06712 あと、Clone FLA-1もよかった記憶が。M2はFLAG開発したSigmaのものだけど、後発抗体もいろいろいいのあるということだね。

(無題) 削除/引用 No.9399-12 - 2020/12/31 (木) 20:15:49 - TOK > これほどM2との違いがあればもっと広まっている気がするのですが、今まで聞いたことがなかったので、興味があります。 独占販売かどうかはわかりませんが、ライセンスに出したところが大手ではないですね（失礼）。あと、リンク先を読むと、N末側にFLAGを付けた場合しか認識しないこと、3xFLAGはダメなことなど癖があり、常にM2越えするのかちょっと不安も。でも、私も試してみようかなとも思う。

(無題) 削除/引用 No.9399-11 - 2020/12/31 (木) 07:53:16 - おお >[Re:6] 　vbんjkmさんは書きました : > 分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの３段階でもかなりいい感じに濃縮できる。 一度やる価値があるとおもいます。ただ組織であまりLysateを作るとき見ないのでちょっと躊躇していました。 たとえば等張でもしっかりホモジナイズするとミトコンドリアが単離できますし、細胞質にある可溶性蛋白であれば、弱いデタージェントでしっかりホモジナイズすれば溶出してきて、あまり繊維状の成分などを可溶化しない状況で細胞内の蛋白が溶出できるのではないかと思ってます。組織なそれなりのホモジナイズ（物理的分散）が必要なので、そこだけ注意したほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9399-10 - 2020/12/30 (水) 22:05:20 - kent COIさん 情報ありがとうございます。 お使いになられたことはありますか？ これほどM2との違いがあればもっと広まっている気がするのですが、今まで聞いたことがなかったので、興味があります。 >[Re:7] COIさんは書きました : > https://www.transgenic.co.jp/products/antibodies-product/transgenic/detail/KO602-S.html > > http://plaza.umin.ac.jp/j_bio/2h8.html

(無題) 削除/引用 No.9399-9 - 2020/12/30 (水) 22:03:41 - kent vbんjkmさん 部位で大きな差はないと想定していますが、現在同時にIHCも行っています。 分画も確かに有用化と思います。 ありがとうございます。 >[Re:6] 　vbんjkmさんは書きました : > > > > 脳全体で発現してるの？部域で差異はないの？あればそこだけ取ってくるとか。 > 分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの３段階でもかなりいい感じに濃縮できる。

(無題) 削除/引用 No.9399-8 - 2020/12/30 (水) 22:01:58 - kent TOKさん L5の情報、ありがとうございます。 試されたことはありますか？ あればぜひ感想をお聞かせください。 4C5とM2との比較がOrigeneのサイトにありましたが、発売元が示しているデータですので、実際に試された方のレビューを聞きたいと思っていました。 origene.com/products/antibodies/tag-antibodies >[Re:5] TOKさんは書きました : > Origeneのクローンは知りませんでした。このクローンがよさげというはどのような理由からですか？

(無題) 削除/引用 No.9399-7 - 2020/12/30 (水) 21:37:38 - COI https://www.transgenic.co.jp/products/antibodies-product/transgenic/detail/KO602-S.html http://plaza.umin.ac.jp/j_bio/2h8.html

(無題) 削除/引用 No.9399-6 - 2020/12/30 (水) 20:49:21 - 　vbんjkm 脳全体で発現してるの？部域で差異はないの？あればそこだけ取ってくるとか。 分画はkitもあるけど、界面活性剤フリー低張buffer→遠心→沈殿を0.5%TritonX100 bufferに溶かす、→遠心→沈殿をSDS-sammple bufferの３段階でもかなりいい感じに濃縮できる。

(無題) 削除/引用 No.9399-5 - 2020/12/30 (水) 13:41:54 - TOK Origeneのクローンは知りませんでした。このクローンがよさげというはどのような理由からですか？

(無題) 削除/引用 No.9399-4 - 2020/12/30 (水) 13:37:10 - TOK サイドバイサイドで比較したわけではないのですが、私はクローンL5にたどり着きました。 販売会社のTDSからそのまま抜き出すと、 The L5 clone has been demonstrated to have 2-8 fold better sensitivity in WB than another commonly used antibody clone, M2. だそうです。

(無題) 削除/引用 No.9399-3 - 2020/12/30 (水) 02:43:48 - kent おおさん、 組織は脳で、RIPAを加えてsonication後、遠心で上清を使っています。 培養細胞で発現させた際の発現確認に同様な方法を使っていました。 培養細胞に比べて細胞の割合が少ないなどで発現が難しくなることは想定していましたが、あと少し感度を上げて検出したいと思っています。 >[Re:2] おおさんは書きました : > 抽出方法などの工夫で感度があがることはあると思いますが、そういう方法論的なものはどのように対応していますか？

(無題) 削除/引用 No.9399-2 - 2020/12/30 (水) 02:23:57 - おお 抽出方法などの工夫で感度があがることはあると思いますが、そういう方法論的なものはどのように対応していますか？

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