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生細胞のin vivoトラッキングについて トピック削除
No.9387-TOPIC - 2020/12/23 (水) 11:28:43 - 匿名
表題の件に関して現在頭を悩ましています。

マウスに細胞を投与した後に,生細胞だけを定量的に検出したいのですがいい方法が思いつきません。

単純に蛍光染色や,GFPを発現させてしまうと死細胞も検出してしまうので,生細胞だけを追うことができません。
すべてのタイプポイントごとにマウスを用意して,各ポイントごとに切片作成して免染という方法もありますが,あまり現実的に採用できそうにありません。

何かいい方法をお持ちでしたら,お知恵を拝借させていただけますと幸いです。

よろしくお願いいたします
 
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IVIS 削除/引用
No.9387-14 - 2020/12/25 (金) 19:56:23 - ema
機器としてIVISはお勧めです。
メーカーがとうとうレンタルと計測を始め使いやすくしてくれています。

https://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/products/rental/flow.html

(無題) 削除/引用
No.9387-13 - 2020/12/24 (木) 09:01:06 - 匿名
皆様

Cell Explorerのメーカーに問い合わせてみたところクリスマス前だからかやたら簡素な返事がきました ” Yes, the live-cell tracking kits can distinguish the live and dead cells. Thanks!”

皆様の議論を踏まえて,Cell Explorer と Lucでまず考えてみたいと思います。
imagingの分野はあまり明るくなかったのですが,皆様のコメントで何とか進められそうな気がします。

今回初めての投稿でしたが実りあるものとなったのは皆様のおかげです。ありがとうございました。

それでは皆様よいお年を

(無題) 削除/引用
No.9387-12 - 2020/12/24 (木) 06:36:51 - たろー
>[Re:11] iiさんは書きました :
> 僕もin vivoの発光イメージングやりてーって思ってるんですけど、発光はシグナルが非常に小さいので、それ専用にチューンされた検出装置じゃないと検出できない上、それほど多くの人がやっている事でもないので、利用できる範囲に装置が見つからないのですよね・・・。

うーん、それはおっしゃる通りなのですが、なかなか他にいい案が思いつかないですね・・・PETはPETで高いし、共用で簡単に利用できるところも少ないですし。
それ以外だと、最初に質問者さんが挙げていた、タイムポイントたくさんとって力業で免染が一番現実的なような気がします。固定する前に生きていた細胞を判別するのはそれはそれで色々しないといけないとは思いますが。

(無題) 削除/引用
No.9387-11 - 2020/12/24 (木) 05:19:29 - ii
僕もin vivoの発光イメージングやりてーって思ってるんですけど、発光はシグナルが非常に小さいので、それ専用にチューンされた検出装置じゃないと検出できない上、それほど多くの人がやっている事でもないので、利用できる範囲に装置が見つからないのですよね・・・。

(無題) 削除/引用
No.9387-10 - 2020/12/24 (木) 03:24:29 - たろー
感覚的には、96wellなどのvitroのアッセイだと、死細胞(の入っているwell)でもルシはよく光るという印象があり、ATPが流されなければ死んでもしばらくは発光すると思っています。
見る臓器にもよりますが、死んだ細胞に比べて十分に系が広く、拡散する環境ならいけるのではないかと思っています。無責任ですみませんが、裏付けとなる文献をしっかり調べたことはありません。でも多分あるのではないでしょうか?

in vivoで特に肺に詰まった細胞を見たいのなら、そもそも血液循環は保たれている部位しょうし、タイムスケールにもよりますが、死細胞が同じ部位にとどまり続けるとは考えにくいですし、発光でよいのでは?多少の理論武装は必要な気もしますが、いくつかコントロールの実験やれば十分何とかなりそうな気がします。
最近は長波長で外からでも高感度で見えるルシもありますし、PETよりは現実的な路線ではないかと。

(無題) 削除/引用
No.9387-8 - 2020/12/24 (木) 02:25:51 - おお
>[Re:7] ぽーさんは書きました :
> in vivoルシフェラーゼアッセイはどうでしょうか?
> ルシフェラーゼはATP依存的ですので、理論上は死んだ細胞では発色しません。

わたしもそう考えて、コメント書こうと思ったんです。でもふと思ったんです。死んだ細胞が一箇所に固まってたら、放出されたATPがうまく拡散されないかもって、、、発現しているルシフェラーゼもそのあたりに残っているだろうし。考えすぎかもしれませんし、そういう懸念がなければいいアイデアだと思います。

(無題) 削除/引用
No.9387-7 - 2020/12/23 (水) 18:25:45 - ぽー
in vivoルシフェラーゼアッセイはどうでしょうか?
ルシフェラーゼはATP依存的ですので、理論上は死んだ細胞では発色しません。

(無題) 削除/引用
No.9387-6 - 2020/12/23 (水) 14:46:41 - 匿名
s 様

コメントありがとうございます。
そうですね,メーカーへの問い合わせも効果的ですね。

さっそく問い合わせてみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.9387-5 - 2020/12/23 (水) 14:31:12 - s
live cell trackingで検索すると、コスモ・バイオが売っているCell Explorerという製品がヒットしますが、これは使えないでしょうか。また、サーモ(旧Molecular Probes)のテクニカル・サービスに連絡すると相談にのってくれそうな気がします。

(無題) 削除/引用
No.9387-4 - 2020/12/23 (水) 14:17:04 - 匿名
たろー様

早速の回答ありがとうございます。

具体的な試験のイメージとしては,細胞をIV投与して肺に詰まったあとの
生死情報をトラッキングしたいと思ってます。

はじめは蛍光orPETで見ようと思っていたのですが,
確実に生細胞か死細胞かを見極める必要があったために質問いたしました。

”見る臓器・細胞や死に方にもよりますが、膜が破れたりするからか、普通に死んだ細胞は発光タンパクも蛍光タンパクも大抵は光らなくなる気がします。”
というコメントのエビデンスとなる論文などはご存じでしょうか?

というのも私も感覚的にそのように思うのですが,
論文があれば理論補強できるので,もしすぐに見つかるようでしたら,
ご教授いただけますと幸いです。

よろしくお願いいたします

(無題) 削除/引用
No.9387-3 - 2020/12/23 (水) 12:46:04 - たろー
外からアクセスできない固形臓器にいる細胞を非侵襲で数日間トラックしたいなら、発光か放射線(PETとか)のほぼ2択ではないかと思います。

見る臓器・細胞や死に方にもよりますが、膜が破れたりするからか、普通に死んだ細胞は発光タンパクも蛍光タンパクも大抵は光らなくなる気がします。もちろん生細胞であると断言するには別の方法での確認も必要とは思いますが。

(無題) 削除/引用
No.9387-2 - 2020/12/23 (水) 12:10:44 - たろー
見る臓器とか、もう少し情報が欲しい気がします。
例えば血球だと少量の検体を採取してFACSとかで見るときに生細胞染色するのは容易ですが(もはやin vivoではないですが)、脳や肝臓にいる生細胞をトラックしたいとかいう話だと大分話が変わってきます。

生細胞のin vivoトラッキングについて 削除/引用
No.9387-1 - 2020/12/23 (水) 11:28:43 - 匿名
表題の件に関して現在頭を悩ましています。

マウスに細胞を投与した後に,生細胞だけを定量的に検出したいのですがいい方法が思いつきません。

単純に蛍光染色や,GFPを発現させてしまうと死細胞も検出してしまうので,生細胞だけを追うことができません。
すべてのタイプポイントごとにマウスを用意して,各ポイントごとに切片作成して免染という方法もありますが,あまり現実的に採用できそうにありません。

何かいい方法をお持ちでしたら,お知恵を拝借させていただけますと幸いです。

よろしくお願いいたします

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