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(無題) 削除/引用 No.9385-17 - 2020/12/24 (木) 02:52:18 - おお >トランスファーはCriterion™ ブロッターていうのを使っています。100V 30分でやっています。ゲルを染めたことはないので検討してみます。メンブレンはPVDFを使っています。 あ、電極がワイヤーでなくプレートになっているということですね。確かにワイヤーよりいいという噂ですが実際のところどうなんでしょう。 PVDFなら１００Vで短時間より２５VぐらいでO/Nでやったりしています。高分子もかなりの効率でTransferできますし、PVDFなら２０％メタノールSDS不含で低分子（１０キロあたりまで）であまりすり抜けていないようです。ちなみに私は Towbin Buffer べーすです。 蛋白抽出条件もマイルドにして細胞質のタンパク質中心に抽出すると、目的の蛋白がある意味濃縮されている状態になりますのでそこも考えてみるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9385-16 - 2020/12/23 (水) 19:04:45 - 無名 一応、ご参考まで。 タンク式で400mAで90分転写。 イモビロンメンブレン 2パーセントBSAでブロッキング 抗体希釈液も2パーセントBSA ジャクソン二次抗体、イモビロン発色液です

(無題) 削除/引用 No.9385-15 - 2020/12/23 (水) 18:59:56 - 無名 血球系を使っていますが、CST#9662 ラボにあります。 35KDaのバンドは顕著に出ます。 cleaved caspase3は見にくいですね。 抗体買って数週間程度でしたら、CSTに相談したほうが良いですよ。 そういうフォームがCSTのホームページにあります。 ロットを買えてくれることがあります。

(無題) 削除/引用 No.9385-14 - 2020/12/23 (水) 02:25:17 - おお >[Re:13] 　vbんjkmさんは書きました : > 抗体を買い換えるのが一番良いと思います。安易だと偉い人たちに叱られるかもしれませんが、現実的にはこれが一番早道のことが多いです。 そのまえにCST#9662の評判をきいてみたほうがいいのではないかと。この手の抗体は非常によく使われるたぐいなので。加えてどの抗体が良かったかも情報が得られるだろうし。また逆の見方をするとSDSPAGEやWBがちゃんとできてないとどの抗体使ってもだめだと思う。 ちなみにPubmed centralでcleaved caspase 3 9662 で検索すると 1426件みつかり最初の１１件を見る限りこの商品がWBで使われています。ただAlternativeな商品があるならどなたかSuggestionがあってもいいかと。

(無題) 削除/引用 No.9385-13 - 2020/12/23 (水) 01:43:17 - 　vbんjkm 抗体を買い換えるのが一番良いと思います。安易だと偉い人たちに叱られるかもしれませんが、現実的にはこれが一番早道のことが多いです。抗体がアレだとどこをどう工夫、改変してもただ時間が過ぎて疲れるだけなので。しなくて済む苦労は出来るだけしない方がいいです。 メーカーにも相談して事情を話してみてください。買ったのがあまりいけてないロットだと他からも問い合わせが来てたりするので。会社にもよりますが別ロットを出してくれるところもあります。 apoptosisの検出が目的ならばcaspase3にこだわらなくてもいろいろ方法はあると思うし、目的に叶えばなんでもいいわけですし。caspase3の研究をしてるということではないと思うので、目的が何かを考えてもう少し広い視点で頑張ってみましょう。

(無題) 削除/引用 No.9385-12 - 2020/12/23 (水) 00:00:32 - 実験初心者 >[Re:10] 無名さんは書きました : > すいませんが、お使いの細胞株でcaspase3が動くと思われる根拠を教えて頂けませんでしょうか。 > > z-vadとか、アネキシンPIとかでしょうか。 アオネキシンPIやTUNELアッセイでアポトーシスが生じていると思われるのとCleaved PARPのバンドはいつも出るので、そう思いました。

(無題) 削除/引用 No.9385-11 - 2020/12/22 (火) 23:58:59 - 実験初心者 >[Re:8] おおさんは書きました : > プレートってなんですか？セミドライなら１００Vはきついと思うけど。それともWetですか？ならばちょっと短めです。使っているバッファーも不明だし、、、Transfer後のゲルを染めて確認したことはありますか？それとも最近でたBioradのTurbo Transfer Systemですか？またメンブレンがNCかPVDFかによってもちがったアドバイスになることがあります。 トランスファーはCriterion™ ブロッターていうのを使っています。100V 30分でやっています。ゲルを染めたことはないので検討してみます。メンブレンはPVDFを使っています。 > > 現在スキムミルクをブロッキング剤で使っているのですが、目的タンパク質のバンドがマスクされる可能性があるようなので、他のブロッキング剤を使って検討してみます。 > そういう話は個人的にはあまり聞きませんが、そのソースはなんですか？その抗体特異的なものですか？たしかにO/Nブロッキングだったらもしかしたらそうかも知れませんけど。 ソースはどこかのサイトのトラブルシューティングの項で見つけました。

(無題) 削除/引用 No.9385-10 - 2020/12/22 (火) 20:13:03 - 無名 すいませんが、お使いの細胞株でcaspase3が動くと思われる根拠を教えて頂けませんでしょうか。 z-vadとか、アネキシンPIとかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9385-9 - 2020/12/22 (火) 18:09:17 - G25 > 現在スキムミルクをブロッキング剤で使っているのですが、目的タンパク質のバンドがマスクされる可能性があるようなので、他のブロッキング剤を使って検討してみます。 HNどおり、実験初心者であるなら、こう助言しましょう。 ドラブルシューティングは場当たり的な思いつき、たまたま聞きかじったことなんかで闇雲にやってはいけません。それじゃ、ヤクザのチャンバラです。 もっと順序立ててシステマティックに検討しなければ。 どのステップまで問題がなくて、どこから様子がおかしいのか？ 泳動で問題はないのか（かなりの低分子量だけれど分離やバンディングに問題ないか）、 トランスファーはうまくいっているか（移動効率、捕捉効率などでロスはないか。特に低分子量を十分に捕捉できるメンブレンや条件なのか）、 抗体の質や量、標識、検出剤、検出器低などに問題はないか、 などなど、 可能性があるポイントはたくさんあるはずです。例えばそういうところ、全部クリアした上で、「ブロッキングが、、、、」とか言っているのだろうか？　じゃないよね。たしかにオーバーブロッキングという現象はあるけれど、その前に、いろいろ、検討することがあるんじゃない？と思います。 考えられることはたくさんあるけど、あなたの実験を直接見たわけでないんですから。何をやってこういう事が起こったか記載して、ポイントを押さえた情報を出さなければ、実のあるディスカッションになりませんよ。

(無題) 削除/引用 No.9385-8 - 2020/12/22 (火) 14:17:21 - おお >[Re:7] 実験初心者さんは書きました : > ご指摘ありがとうございます。 > 検出感度が低いのがバンドが出ない原因と考えて検討しています。 > だから電気泳動やトランスファーをどのように行ったのか聞いたのですが、情報が不足しすぎています。 ＞トランスファーはプレート用いて100V30分 プレートってなんですか？セミドライなら１００Vはきついと思うけど。それともWetですか？ならばちょっと短めです。使っているバッファーも不明だし、、、Transfer後のゲルを染めて確認したことはありますか？それとも最近でたBioradのTurbo Transfer Systemですか？またメンブレンがNCかPVDFかによってもちがったアドバイスになることがあります。 > 現在スキムミルクをブロッキング剤で使っているのですが、目的タンパク質のバンドがマスクされる可能性があるようなので、他のブロッキング剤を使って検討してみます。 そういう話は個人的にはあまり聞きませんが、そのソースはなんですか？その抗体特異的なものですか？たしかにO/Nブロッキングだったらもしかしたらそうかも知れませんけど。

(無題) 削除/引用 No.9385-7 - 2020/12/22 (火) 13:50:31 - 実験初心者 ご指摘ありがとうございます。 検出感度が低いのがバンドが出ない原因と考えて検討しています。 現在スキムミルクをブロッキング剤で使っているのですが、目的タンパク質のバンドがマスクされる可能性があるようなので、他のブロッキング剤を使って検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.9385-6 - 2020/12/22 (火) 09:30:15 - おお >full lengthは35KDaでうっすら見えるのですが・・ full lengthがまともに検出できないような感度ならCleaved caspase 3が検出できなくてもおかしくはないです。検出感度を上げるべきだと思います。抽出、泳動、トランスファー、検出、いずれもチェックポイントですのでそれぞれ点検しながらベストの条件を見つけてください。

(無題) 削除/引用 No.9385-5 - 2020/12/22 (火) 08:43:09 - 実験初心者 > おおさん 電気泳動は50V 30分、150V 45分で流してます。 トランスファーはプレート用いて100V30分で流しています。どちらもBio-radの器械を用いています。細胞はSYO-1 滑膜肉腫細胞です。 >ごんべえさん ＃9662を用いると、full lengthは35KDaでうっすら見えるのですが・・　17KDa付近では何のbandも見えません。

(無題) 削除/引用 No.9385-4 - 2020/12/22 (火) 08:00:52 - ごんべえ Caspaseの検出は案外トラブルがよく起こります。 条件が分かりませんが一般的な観点で注意点を言います。 ・Staurosporine等での「典型的」なアポは、血球細胞で顕著だが細胞によっては、（接着細胞はその傾向が強い）ネクローシスに傾く場合が多いです。DNA ladder等も同様の傾向を示します。 ・典型的なアポが観察されることが知られている細胞以外でCaspase cleavageを見たいのならば、full lengthもみえる抗体を用いる方が良い（これならFLの現象が起こっているかや、中間体がどうか等多角的に評価ができます） ・今回は該当しないようですが、種特異性がある抗体が比較的多い いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9385-3 - 2020/12/22 (火) 07:27:09 - おお 電気泳動やトランスファーなど詳細な条件を開示してみてはどうでしょうか？また、細胞は何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9385-2 - 2020/12/22 (火) 00:45:31 - おお >[Re:1] 実験初心者さんは書きました : > ポジコン（Staurosporin 添加）も出ません。今用いている抗体（CST#9662）がダメなのか・・ https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/caspase-3-antibody/9662 検出できてますよ？

Western blotでCleaved caspase 3のバンドが出ない原因 削除/引用 No.9385-1 - 2020/12/21 (月) 21:52:34 - 実験初心者 明らかに他の実験結果でアポトーシスが生じていると考えられる阻害剤を用いたWestern blottingにて、Cleaved caspase 3のバンドが何回やっても出ない原因として考えられることは何ですか？ ポジコン（Staurosporin 添加）も出ません。今用いている抗体（CST#9662）がダメなのか・・新しくCleaved caspase 3抗体(CST#9661)の購入を考えています。

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