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(無題) 削除/引用 No.9369-11 - 2020/12/11 (金) 15:33:08 - yoko >No.9369-10 - 2020/12/11 (金) 13:39:45 - おお おおさん、詳しくご教示いただきありがとうございました。尿素/DTTの方法を中心に精製方法を改良してやってみます。

(無題) 削除/引用 No.9369-10 - 2020/12/11 (金) 13:39:45 - おお >[Re:9] yokoさんは書きました : > 　タンパク質を変性してからの精製は確かにいい方法かもしれません。boilによる熱変性でよろしいでしょうか？ グアニジンや尿素を含んだバッファーで精製すればいいです。Ni-NTAの精製方法のプロトコールを探すと色々と見つかります。 注意点はグアニジンはSDSとの相性が悪く、グアニジンを含むサンプルをサンプルバッファーと混ぜると沈殿してしまいます。溶出したあとに透析するとか、アセトンなどで沈殿させて除くとか必要です。たしか尿素存在下では沈殿しなかったとおもうので、電気泳動の際はサンプルを１０M、尿素（DTTをふくむ）と等量加えボイルせずそのままSDSPAGEということもできるとおもう（ちょっと自信ない）。 尿素はボイルしたり、長期間尿素入りの蛋白溶液を保存したりすると副産物が蛋白と反応するので、尿素入りのサンプルをSDSPAGEにかけたいときはサンプルバッファーを加えてもボイルせずに流してます。還元が十分か気になるならDTTを加えておくといいです。 Lysisするときにこのような変性剤を含むバッファーだとしばしDNAも溶け出てきてどろどろになることがある。尿素なら低塩濃度でマグネシュームを５mMぐらい入れておけばどろっとしたDNAもなんとか遠心で分けれると思う。グラスビーズを入れておくとそれにDNAが絡まるので分けやすい。 あなたのつかっているLysisばっふぁーでライセートを作ってから素早く尿素かグアニジンを加えてもいいでしょう。そちらのほうがNi-NTAなどの特有なノンスペの蛋白を多く持ち込まなくてもすむかもしれない。ただしLysis中に分解したと突っ込まれるとどうかな、、、大抵は大丈夫だけど。

(無題) 削除/引用 No.9369-9 - 2020/12/11 (金) 11:39:19 - yoko No.9369-8 - 2020/12/10 (木) 17:48:22 - おお >GFPの抗体を使用しました。whole cell lysisで非特異的なバンドが出ましたので精製しました。 ネガコンがあれば特異なバンドが同定できるのではないか？ 何が目的かわからないが、変性状態でNiNTAで精製すれば精製時の分解は防げるけど。 それでもサイズが変わらないなら、全長でもその位置にMigrationする可能性も考えていいかと思う。SDSPAGEので見積もられるサイズなんて結構ずれたりするもんですから。酸性のアミノ酸が多いとかありますか？ ----------------------- 　whole cell lysisのネガコンにおいて、自分の理解が正しいかどうか分かりませんが、untreated及びempty vector(GFPのみ)両方とも60~150kにおいて、目的タンパク質と似たようなバンドのパタンが検出されました。 　酸性アミノ酸(D+E)は約11%ですので、多くはないと思います。 　タンパク質を変性してからの精製は確かにいい方法かもしれません。boilによる熱変性でよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9369-8 - 2020/12/10 (木) 17:48:22 - おお >GFPの抗体を使用しました。whole cell lysisで非特異的なバンドが出ましたので精製しました。 ネガコンがあれば特異なバンドが同定できるのではないか？ 何が目的かわからないが、変性状態でNiNTAで精製すれば精製時の分解は防げるけど。 それでもサイズが変わらないなら、全長でもその位置にMigrationする可能性も考えていいかと思う。SDSPAGEので見積もられるサイズなんて結構ずれたりするもんですから。酸性のアミノ酸が多いとかありますか？

(無題) 削除/引用 No.9369-7 - 2020/12/10 (木) 17:33:16 - yoko No.9369-6 - 2020/12/10 (木) 16:02:01 - み 細胞内ではintactだったとしても、抽出した時に限定分解を受けている可能性が否定できない。N末とC末それぞれの抗体で同じサイズで検出されるか確かめた方が良い。 すでに意見出てるけど免疫沈降なんかせずtotal lysateで見ることが先決だろうけど。 ---------------------------------------- 　ご返答ありがとうございます。 　おおさんへの返答に書き漏らしてすみません。対象タンパク質は抗体は市販のものがなく、自分で作らなければいけないので、GFPの抗体を使用しました。whole cell lysisで非特異的なバンドが出ましたので精製しました。 　確かに仰る通り、抽出した時に限定分解を受けている可能性があります。lysisを自分で作り直してやってみます。

(無題) 削除/引用 No.9369-6 - 2020/12/10 (木) 16:02:01 - み 細胞内ではintactだったとしても、抽出した時に限定分解を受けている可能性が否定できない。N末とC末それぞれの抗体で同じサイズで検出されるか確かめた方が良い。 すでに意見出てるけど免疫沈降なんかせずtotal lysateで見ることが先決だろうけど。

(無題) 削除/引用 No.9369-5 - 2020/12/10 (木) 16:00:36 - yoko No.9369-2 - 2020/12/10 (木) 15:42:06 - おお 発現している細胞をそのままLysisしてWBしても同じサイズに出ますか？ 精製するときのLysisBufferは何ですか？ --------------------------------------- 　ご返答ありがとうございます。 　精製するときのLysisBufferは、Thermo社のNi-NTA Resin精製protcrolに勧められた同社の B-PER™ Bacterial Protein Extraction Reagent を使用しました。

(無題) 削除/引用 No.9369-4 - 2020/12/10 (木) 15:57:11 - yoko No.9369-3 - 2020/12/10 (木) 15:45:10 - qq ＞C末端が切断されれば核移行はしません。 これは、確認済みでしょうか？ -------------------------------- 　ご返答ありがとうございます。 　C末端が切断されれば核移行しないのはdeletionとpoint mutation実験で確認済みです。

(無題) 削除/引用 No.9369-3 - 2020/12/10 (木) 15:45:10 - qq ＞C末端が切断されれば核移行はしません。 これは、確認済みでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9369-2 - 2020/12/10 (木) 15:42:06 - おお 発現している細胞をそのままLysisしてWBしても同じサイズに出ますか？ 精製するときのLysisBufferは何ですか？

western-blotのバンドのサイズが予想より小さい 削除/引用 No.9369-1 - 2020/12/10 (木) 14:43:45 - yoko 　plasmidの配列確認済みのHIS-GFP N末端タグ付き、分子量70k程度のタンパク質を昆虫細胞に発現させました。 　蛍光を検出したところ、GFPやタンパク質の核内移行(配列はC末端に近い)が確認されました。 　その後、Ni-NTA Resinで精製し、GFPの抗体でタンパク質の発現を確認しました。結果として、タグ合わせて95kあたりに検出されると予想したバンドが75kに出ました。一方、同じやり方で発現、精製した80k程度の他のタンパク質が予想したサイズ(110k)あたりに検出されました。 　N末端が切断されれば精製/GFPの検出は出来ないし、C末端が切断されれば核移行はしません。数回繰り返して再現性が取れましたが、理由は思いつきません。わかる方が居ればご教示いただけると嬉しいです。

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