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(無題) 削除/引用 No.9368-7 - 2020/12/10 (木) 18:12:02 - おお >[Re:5] fさんは書きました : > KOがないと、ChIPのちゃんとしたvalidationは難しいです。 > > qPCRのシグナルがnIgGと比べて高いからといって、それは特異的なターゲットを検出しているということではないので。 なるほどと思ったのですが、スペシフィックな抗体を使うけどターゲットのタンパク質が発現していないのと、ノーマルIgGを使うが目的のタンパク質が発現している状態を考えると、共通点は抗体を使うこと、ターゲットのタンパク質が沈降しないことで、どちらも系としてはあまり差がない様に思える。つまり同様にバックグランドを拾いそうな気がするのですが、気のせいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9368-6 - 2020/12/10 (木) 18:01:01 - おお 無名に近いと言うけど転写因子と考えられるのなら、どの分類に属するのかわかるのでは？ qPCRで濃縮が確認できると言うなら大体どこに結合するかわかってるのですか？ その位置の前後何箇所か取るとピークの位置がもっともらしいという結論がだせるし、濃縮されていると言えるでしょう。 それか期待している配列の周辺でオリゴを作って、ゲルシフトアッセイするとここはつかないとか検討がつくでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9368-5 - 2020/12/10 (木) 17:41:46 - f >おっしゃる通り、ノックアウトされたサンプルであれば、差異が明確になりますが、今は準備できない状況です。 KOがないと、ChIPのちゃんとしたvalidationは難しいです。 qPCRのシグナルがnIgGと比べて高いからといって、それは特異的なターゲットを検出しているということではないので。

(無題) 削除/引用 No.9368-4 - 2020/12/10 (木) 17:36:04 - kk まず前提として、ChIP-seqでは配列を読む前には、ChIPをしたあとに、qPCRで、濃縮されていることを確認するのが定石です。 やみくもにシークエンスを読んでも、費用と労力の無駄になります。 ベースラインとピークというのは読んだあとの話ですよね？ 有名な分子であれば、consensus配列がある程度予想されているのかもしれませんが、無名に近い転写因子をターゲットにした場合にはどこに結合するかは読めません。またサンプルが異なれば、クロマチンの状態が大きく異なりますので、sampleによる差異もあります。 おっしゃる通り、ノックアウトされたサンプルであれば、差異が明確になりますが、今は準備できない状況です。

(無題) 削除/引用 No.9368-3 - 2020/12/10 (木) 09:46:21 - おお ニュートラルな抗体使えばいいんじゃないの？ コンセンサス配列はないの？ どういう実験デザインかよくわからないけど、ある程度の領域をスキャンするようにすると、ベースラインとピークを見分けられるだろうから、その後ベースラインのあたりは随時ネガコンで利用できると思おもう。 アプローチもそれぞれだろうから、適当に見えるのだろう。

(無題) 削除/引用 No.9368-2 - 2020/12/10 (木) 07:24:12 - f ノックアウトでChIP-seqするしかない。

ChIP-seqのコントロール 削除/引用 No.9368-1 - 2020/12/10 (木) 06:03:22 - kk ChIP-seqのqPCRコントロールどのように設定していますか？ 初めて扱うサンプルのどこにどのタンパク質が結合するかなんて、誰も読めませんよね？ もちろん既に解析されたことがあるサンプルをコントロールに置けば一番いいと思いますが、多くの研究者はダイレクトに目的サンプルを解析して、適当な(適切という意味です)遺伝子あるいはサテライトDNAをコントロールにしていますが、みんなまちまちで、本当に適当に見えます。

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