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FACSの解析について。 トピック削除
No.9365-TOPIC - 2020/12/09 (水) 16:59:34 - 匿名
FACSの解析に関して、お聞きしたいことがあり投稿しました。
（初心者です。）

具体的には、抗体のシグナルのpositive/negativeの境界をどのように決めるべきかについてです。

現在はある色素において、No stainの中で一番強いシグナルまでをnegativeとして解釈しています。（10^3のラインまでnegativeのシグナルがあれば、10^3〜をpositiveとして解釈）
しかし、視覚的に細胞集団が分かれているのが確認できるものに対してこの解釈の仕方をするとずれがあります（positiveの境界が厳しすぎる）。
（説明下手で申し訳ございません。。。）


FACSを使っている皆様が、普段どうやってpositive/negativeの境界を決めているのか、参考にさせていただきたいです。
よろしくお願い申し上げます。
　
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(無題) 削除/引用
No.9365-5 - 2020/12/14 (月) 18:32:05 - 匿名
＞ど素人さん

ご回答ありがとうございます。
また、丁寧な説明ありがとうございます。

isotypeコントロールを用いた際も、やはりカットオフ値をどこにするかが曖昧で戸惑っています。。
やはり自分が扱う組織・抗原によって、主観でちょうどよさそうなのを見つけるしかなさそうですね。。

参考になりました！

(無題) 削除/引用
No.9365-4 - 2020/12/11 (金) 17:21:52 - ど素人
ヒトかマウスか (はたまたサルか) などによって異なりますが...

もし Treg を解析しているなら、CD127 を同時に標識するのがよい場合があります。
一般的な Treg は CD25陽性 CD127陰性といわれています。
もし細胞内 (というより核内) 標識試薬があるなら、Foxp3 を標識し、CD25陽性Foxp3陽性細胞をとったりします。

また、抗原の発現パターンの特徴の把握が大切となります。
T細胞を観察する場合、たとえば CD4 の陽性と陰性はかなり明らかです。
しかし CD25 の発現量は細胞によって様々であり、陽性と陰性に区切るのは必ずしも容易ではありません。
CD25 陽性のうちの強陽性をみたいのか弱陽性をみたいのかなど、目的をあらかじめ明確にすることが必要です。

どうしても陽性と陰性の 2 つに分ける場合は、no stain を使う場合もありますが、isotype control (IgG1, IgG2a, IgG2b, さらにはκ、λなど揃えた非特異的抗体) というのを使う場合が多いかもしれません。(調べてみてください)

その場合でも主観は入ります。例えば isotype control で 0 のところを採る人もいれば、0.1 % の所をとる人もいれば、1 % でとる人もいます。データの品質にもより、ノイズの多いデータだとカットラインは難しくなります。

(無題) 削除/引用
No.9365-3 - 2020/12/11 (金) 14:33:59 - 匿名
＞NPさん

現状、CD25をPEで見ております。（発現が少ないのはわかっていたため。）
MFIの比較、検討してみます。
貴重なご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.9365-2 - 2020/12/10 (木) 08:24:24 - NP
おっしゃられる内容に関しては理解できます。
要は発現量が低い等の理由のため、ネガコンとの分離が悪いというのが原因かと思います。

私の一つのアドバイスはより強い蛍光のついた抗体で染めるといいかと思います。
たとえば今、FITCで染めておられるのなら、より蛍光の強いPEやPE-Cy7なんかに変えてみるなど。
そうすると分離がよくなり、たとえ発現量が少なくても、分離できると思います。

あるいは、mean fluorescent intensity (MFI)で比較するのもありかと思います。
この場合、その集団が持つ蛍光の平均が数値化されるので、たとえピークがネガコンと一部重なってしまっていても、数字の上ではきちんとした差が出るかと思います。

FACSの解析について。 削除/引用
No.9365-1 - 2020/12/09 (水) 16:59:34 - 匿名
FACSの解析に関して、お聞きしたいことがあり投稿しました。
（初心者です。）

具体的には、抗体のシグナルのpositive/negativeの境界をどのように決めるべきかについてです。

現在はある色素において、No stainの中で一番強いシグナルまでをnegativeとして解釈しています。（10^3のラインまでnegativeのシグナルがあれば、10^3〜をpositiveとして解釈）
しかし、視覚的に細胞集団が分かれているのが確認できるものに対してこの解釈の仕方をするとずれがあります（positiveの境界が厳しすぎる）。
（説明下手で申し訳ございません。。。）


FACSを使っている皆様が、普段どうやってpositive/negativeの境界を決めているのか、参考にさせていただきたいです。
よろしくお願い申し上げます。
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