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(無題) 削除/引用 No.9360-14 - 2020/12/12 (土) 07:39:59 - おお >[Re:13] でつさんは書きました : > メンブレンはPVDFの0.45μmのものを使っており、TFは4時間、ゲルは14%でやっています。 １４％ならふつうのアクリルアミドーBisなら（２９：１のやつ）まず大丈夫でしょう。 ４時間ってなんかあまり馴染みがないプロトコールですねぇ。。。バッファーはなんでしょう。 Tris glycineを使っているならWetで１００V１時間でいいと思いますが。セミドライでも条件はちょっと違うけど１時間ぐらいだと思います。高分子は１４％ではTransferできませんが、高分子を検出するためのゲルではないのでそこはあまり気にしなくていいでしょう。どうしてもと言うならOver nightのプロトコールがあるけど現状検出できてないなら抜けてしまうことも気にしたほうがいいかもしれません（PVDFはそんなに問題ないとは思っているけど、特定の蛋白の場合と一般論は違うから）。 Transfer bufferの組成はどうなっているのかわからないですが、メタノール２０％はいると思います。SDSは入れないでください。 0.45μmで大丈夫だとは思うけど、私はどんな場合でも0.２μmぐらいのを使ってます。 まーかーのうつりぐあいとかどうでしょうか？ RNaseAとか流してみてTransferの状況とかみるというのもありといえばありですね。

(無題) 削除/引用 No.9360-13 - 2020/12/12 (土) 00:52:05 - でつ メンブレンはPVDFの0.45μmのものを使っており、TFは4時間、ゲルは14%でやっています。

(無題) 削除/引用 No.9360-12 - 2020/12/11 (金) 17:10:54 - でつ >[Re:7] おおさんは書きました : > Reprobingしてますか？もしそうならどちらが先ですか？メンブレンはNCですかそれともPVDFですか？ > NCは低分子ではトリッキーです。NCで６０分でTransferすると大丈夫だけど、Over nightでは検出しにくいとか、Stripping後で非常に弱くなったりします。 > ＞AとBの切断が起こっていない > もしそうならFlagと同じところにMycのシグナルが来るはずですがどうでしょうか？ > > なにかmycタグを発現したポジコンはないでしょうか？ > > ゲルはグラジエントですか？それとも１２％以上のものを使ってますか？そのばあい１００kDaのものは 別のゲルですか？ Mycのバンドはタンパク質Aと同じ位置に検出されなかったので、P2Aが機能していないということはなさそうです。 メンブレンのポアサイズ以外で検討すべき条件などがあれば教えていただけると嬉しいです。 ストリッピングはしていないです。 Mycの抗体はポジコンで機能することを確認しています。

(無題) 削除/引用 No.9360-11 - 2020/12/09 (水) 06:00:31 - たろー >[Re:9] iiさんは書きました : > 一つのリボソームに2個のtRNAしか同時に入っていられないのに、2A peptideの切断点より3残基以上手前のコドン構成を疑う理由は何なのでしょうか？ 私はP2Aの詳細なskippingのメカニズムを知らないので、過去の経験や先に示した論文を含む既報などから、それより上流の塩基の変化でも切れなくなることがあるからとしか申し上げられないです。逆に切断点より3塩基以上上流の塩基はあまり重要ではないという論文をご存じでしたらご教示いただけるとありがたいです。 P2AやIRESはまだメカニズムのよくわからないトラップが多いので(私が知らないだけかもしれませんが・・・)、特に理由がなければ既報と全く同じ配列を使うのがベターかなと私自身は考えています。 文献はぱっと思い出せませんが、P2Aは温度や細胞腫によっても切れなくなったりすることがあると記憶しており、まず自分の系でどの程度切れているか検討しておくのは必要かなと思います。 ただ、でつさんの場合のように2アミノ酸分のコドンの変更で劇的に変わるかといわれるとあまり自信がないので、mycタグのwesternの結果がわかると嬉しいなと思ったというところです。

(無題) 削除/引用 No.9360-10 - 2020/12/09 (水) 05:34:05 - おお >[Re:9] iiさんは書きました : > 一つのリボソームに2個のtRNAしか同時に入っていられないのに、2A peptideの切断点より3残基以上手前のコドン構成を疑う理由は何なのでしょうか？ いろいろな2A peptidesをアライメントするとその上流にもアミノ酸、DNA配列にコンセンサスがありますね。そのへんをSite direct mutagenesisで調べた論文も見つかるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.9360-9 - 2020/12/09 (水) 04:04:09 - ii 一つのリボソームに2個のtRNAしか同時に入っていられないのに、2A peptideの切断点より3残基以上手前のコドン構成を疑う理由は何なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9360-8 - 2020/12/08 (火) 05:19:00 - たろー ＞＞切断に関わるNPGPの部分は同じなのですがその前にあるいくつかのアミノ酸のうち２つが違うコドンになっています。やはり不味いですかね？免疫染色で見た感じだと局在は違いそうなので切れてはいそうなのですが。 ケースバイケースですが、13kDaくらいだとそんなに検出しにくいという印象はないので、最初の投稿を読んだ際に真っ先にP2Aが切れていない可能性を疑いました。 でつさんの例に当てはまるかはわかりませんが、下記論文のサプリにあるvariant1と4を比べる限りでは、NPGP部分以外の塩基以外の変化でも切れなくなることはありそうです。 ttps://www.cell.com/cell-reports/comments/S2211-1247(15)01363-7#supplementaryMaterial 免染で局在が違うということで否定したいところなのですが、ノンスぺの可能性など考慮すると画像を見ずに議論するのは難しいです。 おおさんと同じく、westernでFlagで染めたとこにMycのバンドがないかが気になります。Mycの検出がworkしている前提ですが、これである程度わかりそうな気がします。 それが否定出来たら他の方のおっしゃる通りポアサイズやメンブレンなどの問題か、aggregationや、glycosylationなどの修飾によりバンドがより違う位置に移動している可能性を疑います。

(無題) 削除/引用 No.9360-7 - 2020/12/08 (火) 04:19:50 - おお Reprobingしてますか？もしそうならどちらが先ですか？メンブレンはNCですかそれともPVDFですか？ NCは低分子ではトリッキーです。NCで６０分でTransferすると大丈夫だけど、Over nightでは検出しにくいとか、Stripping後で非常に弱くなったりします。 ＞AとBの切断が起こっていない もしそうならFlagと同じところにMycのシグナルが来るはずですがどうでしょうか？ なにかmycタグを発現したポジコンはないでしょうか？ ゲルはグラジエントですか？それとも１２％以上のものを使ってますか？そのばあい１００kDaのものは 別のゲルですか？

(無題) 削除/引用 No.9360-6 - 2020/12/08 (火) 03:13:39 - でつ >[Re:2] aaaaaaaaさんは書きました : > 13 kDaとういことでしたらメンブレンのポアサイズを気をつけたほうがいいかもしれません。 > 0.22 umなどのメンブレンを使用してますか？ > > また、AとBの切断が起こっていないという可能性はないでしょうか？ ぽあサイズは0.45μmのものを使っています。 一応そのサイズで10 kDa以下のものを検出したことはあるのですが0.22 umものを購入するべきですかね

(無題) 削除/引用 No.9360-5 - 2020/12/08 (火) 03:11:08 - でつ >[Re:4] たろーさんは書きました : > 別トピでP2Aの塩基配列について質問されていた方かと思いますが、P2Aの配列は既存のものと同一の配列を使用していますか？またP2Aが目的の細胞で切れることは別のタグを使って確認されていますか？ 切断に関わるNPGPの部分は同じなのですがその前にあるいくつかのアミノ酸のうち２つが違うコドンになっています。やはり不味いですかね？免疫染色で見た感じだと局在は違いそうなので切れてはいそうなのですが。

(無題) 削除/引用 No.9360-4 - 2020/12/07 (月) 23:29:05 - たろー 別トピでP2Aの塩基配列について質問されていた方かと思いますが、P2Aの配列は既存のものと同一の配列を使用していますか？またP2Aが目的の細胞で切れることは別のタグを使って確認されていますか？

(無題) 削除/引用 No.9360-3 - 2020/12/07 (月) 23:05:56 - cγfhjk； 13KDaくらいならば12%~15%ゲルならば、一般的な条件で普通に検出できます。アミノ酸組成に偏りがあってpIが極端に高いまたは低いようなタンパク質だと転写が不良になることはあります。この場合、泳動で示される分子量も理論値からかなりズレることがしばしばあります。何かの修飾やSDS耐性のオリゴマーを形成して高分子量化してゲルに入らないで濃縮ゲルやwell下部に引っかかっているとか、不溶化している可能性もあります。この場合は細胞の染色では検出されますが、一般的な生化学的な分析（生化学実験では基本的には対象は一応溶けることが前提なので）ではうまく検出できないことがあります。このような現象は泳動前の加熱処理でより促進されることがありますので、その可能性があるならば、泳動前の加熱なしでやってみることも大切です

(無題) 削除/引用 No.9360-2 - 2020/12/07 (月) 22:59:45 - aaaaaaaa 13 kDaとういことでしたらメンブレンのポアサイズを気をつけたほうがいいかもしれません。 0.22 umなどのメンブレンを使用してますか？ また、AとBの切断が起こっていないという可能性はないでしょうか？ 最後に、どうでもいいことですがP2Aでつないだ遺伝子はORFはひとつなのでモノシストロニックではないでしょうか。

Westen blottingで発現が確認できない 削除/引用 No.9360-1 - 2020/12/07 (月) 19:08:37 - でつ 100kDaほどのタンパク質Aと13kDaほどのタンパク質BをP2A配列でつないでポリシストロニックに発現させ、タンパク質AにはFlagをタンパク質BにはMycタグをつけwestenでサイズ確認をしようとしたところ タンパク質Bのバンドが検出できませんでした。シークエンスは問題ありません。 免疫染色ではFlagの蛍光が見える細胞でMycの蛍光が検出されているため、そもそも発現が起きていないということはなさそうなのですが原因がわかる方いらっしゃいますでしょうか？ タンパク質Bが低分子量タンパク質であるためSDSやtransferの条件を変えてみるなど試行錯誤中です。

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