BioTechnicalフォーラム [ウェスタンブロッティングに関して]

ウェスタンブロッティングに関して

No.9357-TOPIC - 2020/12/06 (日) 03:17:46 - さいとー

ウェスタンにて、A→B→Cの順でアプライし、
バンドの濃さがA>B>Cとなるデータを得たのですが、
本当かどうか順番をC→B→Aにしてアプライしたところ、C>B>Aの濃さになってしまいました。　

なにかどこかでミスをして右側だけ薄くなってしまっていることになると思います。

どのようにすれば改善する余地がありますでしょうか
　

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No.9357-10 - 2020/12/19 (土) 06:32:44 - あの

使用している器具の詳細が明記されていないので
回答しずらいけど、ブロっティング装置の故障が原因かも。

ちなみに、当方では、バイオラドのターボブロッターの
カセットに経年劣化でヒビが入ってきて　同じようなことが
起こり得る状態になりました。

幸い買い換える予算があったから買い替えしたけど、
強力接着剤で補修すれば運が良ければ治せるかも。

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No.9357-9 - 2020/12/18 (金) 23:39:54 - 　cvbhjk

メンブレンをCBBか何かでタンパク質染色してみることを勧めます。

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No.9357-8 - 2020/12/08 (火) 08:32:15 - Skeptic

プラスチックバッグにメンブレンと抗体溶液をシールしてインキュベーションしているなら、バッグの一端から抗体溶液を入れることで抗体濃度のグラジエントができてる可能性があります。封じたあとによく混ぜていますか？

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No.9357-7 - 2020/12/08 (火) 06:11:23 - おお

>[Re:4] おおさんは書きました :
> 濃さの順番が逆ならまだ理解ができるのですが、

理由を伺いたいのですが、、、それとも経験則でしょうか？

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No.9357-6 - 2020/12/07 (月) 13:28:53 - G25

ブロットムラ、抗体や基質のムラなら、一本のレーンの中でもバンド強度が左右でグラディエントになっていそうなものだが、そういう兆候はあるだろうか。

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No.9357-5 - 2020/12/07 (月) 11:21:04 - おお

あまりはっきりとした証拠はないですが、抗体反応液の量によっては角度を変化させるシェーカーで特にはしの方は溶液のそこからの高さは傾くたびに変わるので、若干むらができることがありそうです。振り方をレーンの左右が上げ下げするようにじゃなく、レーンの上下が上げ下げするようにすると同じ高さのバンドに対してはそのようなむらが避けられるかもしれません。

あとはどれくらいの差を見ているのかなども気になります。

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No.9357-4 - 2020/12/07 (月) 10:49:37 - おお

濃さの順番が逆ならまだ理解ができるのですが、
測定を行ったのは2回ですか？そして有意と言えるほどの差ですか？
複数回以上同一条件で行ってその順番に濃さが出るのであれば何らかの癖もしくは手順操作間違いを疑う必要がありますが、そうでなければただのピペットの練習不足で偶然その順番ではないでしょうか。

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No.9357-3 - 2020/12/07 (月) 09:46:26 - み

トランスファーの時に変なバイアスが加わってるのかな？
abcabcと同じサンプルでもduplicateで確認した方が良い

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No.9357-2 - 2020/12/06 (日) 14:55:21 - キャッサバ太郎

よくわからないですが、internal controlはどうなんでしょうか。