BioTechnicalフォーラム [マウスVE-Cadherinの組織染色]

マウスVE-Cadherinの組織染色

No.9352-TOPIC - 2020/12/04 (金) 00:30:07 - IF (Frozen)

マウスVE-Cadherinの組織染色に関してご意見を伺いたく、トピックを作成させていただきました。
よろしくお願いいたします。

私はマウス胎児期15.5における脳血管の構築に関して研究を行なっています。
この度、VE-Cadを染める必要があり、BDから売られている Purified Rat Anti-Mouse CD144. Clone 11D4.1を使って凍結切片を染めてみたのですが、CD31は綺麗に染めるのに対し、VE-Cadは非常に弱く、もしくは全く染まっていません。

この抗体はフローサイトメトリーでの実績もあり、BDやBiolegendが売られているということから考えるとむしろフローサイトメトリーの方が適切なアプリケーションではないかと考えています。ただ、多くの血管生物学のランドマークな論文でClone 11D4.1 は凍結切片にも使われているため、私もそれにならいたいと思っています。

組織は4％PFAで一晩固定後にスクロースに置換し、凍結切片を作成しています。
この抗体を使われてる方がいらっしゃいましたら、工夫などがありましたらご教授いただけませんでしょうか？

adultの肺や腎臓、空腸でも染めてみましたがやはりVE-Cadの染色はみられませんでした。
どのような些細な書き込みも感謝いたします。
よろしくお願い致します。
　

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No.9352-6 - 2020/12/06 (日) 01:38:32 - IF (Frozen)

み様、IHC様、ありがとうございます。

私のラボではE16.5以降は1%もしくは2% PFAで行なっていますが、それよりも前では4% PFAで固定いしています。そうでないと胎児脳では特に薄切できないためです。

アセトン固定は検討するつもりでしたので、行なってみます。
ありがとうございます。

(無題)

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No.9352-5 - 2020/12/05 (土) 23:52:02 - IHC乙

FACSやELISAはいい感じなのに免疫組織染色だとどうも％＆’（％＄＃”’＆なんだがどうよとかいうの時は大抵固定が原因のことが多いというかマウス胚とかみたいに小さいもので一晩とか全然不要というか固定長すぎなのでたぶんこれは固定がアレなんだろうと思うからこれは未固定凍結切片でやってみると多分いいと思うのでそれを書くから気が向いたら騙されたと思ってやってみてくださいその方法は組織切り出し→PBSである程度血を洗って除く→OTCに包埋→未固定凍結→くらいおスタットで薄切→ドライヤーのクールの風で10=20分くらい乾燥→（すぐに免疫染色しないならば-80度で保存）→4%PFA（2％でもいい）/PBSで10~30分くらいの幅で固定→TBSで洗浄→---------みたいな流れです。PFAなどのアルデヒド系は組織の形の維持には良いけど抗原性に影響して抗体との反応が低下しやすいから固定はPFAやめて有機溶媒固定に変えてみることも一つの方法でそれは冷やしたアセトンに５分くらい漬てから自然風乾（ドライヤーは使用しない）で30分くらい放置してみることで少なくともPFA固定よりは抗体の反応性の面ではたぶんいい感じになると思います。

(無題)

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No.9352-4 - 2020/12/05 (土) 09:48:48 - み

固定後コンパウンド包埋するのではなく、生組織を包埋・薄切したあと固定すれば固定液の検討はしやすい。
胎児脳であろうが大概の組織を凍結で見る場合、生組織包埋をデフォルトと考えている。

(無題)

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No.9352-3 - 2020/12/05 (土) 08:20:17 - IF+(Frozen)

ema様、

胎児を対象としているので4％をデフォルトにしていますが、一度濃度を下げてみます。
ありがとうございます。

(無題)

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No.9352-2 - 2020/12/04 (金) 17:04:58 - ema

血管系をやってた時に、この抗体がそうだったかは覚えてないですが、2％PFAにしてうまくいった場合がありました。