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エンドソームでの化合物の分解 トピック削除
No.9349-TOPIC - 2020/12/03 (木) 15:04:05 - FB
いつも拝見させていただいてます。
皆様からアドバイスをいただきたく、トピックを立てさせていただきました。

ある化合物をある担体にアミド結合で複合化して、ドラッグデリバリーを行っています。
この際、エンドサイトーシスよって細胞内に移行することまでは明らかにしていますが、エンドソーム内で化合物が担体から切断されているのかがまだ分かっていません。
化合物が担体から外れるのか、外れないのかが現在の研究のポイントになっています。
担体は消化酵素で分解されるものではなく、アミド結合なので、簡単に分解しないとは考えていますが、実験的にこれを確かめる方法にたどり着けていません（文献も当たっていますが、適切なキーワードが設定できていないものと思います）。
エンドソームをキットで単離して、得られた消化酵素カクテルから試験管内で分解の有無確かめることなどを妄想してみましたが、何か確かめる方法をご存じの方がいらっしゃいましたら、ご教示いただけると幸いです。
宜しくお願い致します。
　
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No.9349-7 - 2020/12/04 (金) 23:59:43 - おお
All of the lysosomal enzymes are acid hydrolases, which are active at the acidic pH (about 5) that is maintained within lysosomes but not at the neutral pH (about 7.2) characteristic of the rest of the cytoplasm (Figure 9.35).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9953/

(無題) 削除/引用
No.9349-6 - 2020/12/04 (金) 16:58:51 - FB
＞おお様
具体的なご提案ありがとうございます。
たしかに細胞を破砕するだけで消化酵素が出てくるはずなので、難しく考えなくてもやれそうですね。
総タンパク質量だけ、ブラッドフォードか何かで定量して基準化しておけば良さそうですね。
pHを振るというのは、酵素の至適pHが酸性側の可能性があるということでしょうか？その場合は、pH4くらいから試すのが良さそうですかね？

(無題) 削除/引用
No.9349-5 - 2020/12/04 (金) 14:25:12 - おお
細胞を物理的に壊して、７０００gぐらいで核とミトコンドリアをのぞいてから、できれば１０００００gで遠心して膜（Microsome Fractions）を回収してそれを使えばいいです。１０００００gが使えないなら３００００gとか５００００gとかでもなんとかなると思います。マイクロチューブで１６０００gぐらいで回収できなくもないですが回収率が落ちるしかたよりがあるかもしれませんが、できなくもない。

それをあなたの物質と混ぜればいいだけです。膜透過性がないなら、弱い界面活性剤を添加すればいいです。pHはふったほうがいいでしょう。とくにLysosomeでは酸性に偏っているので。

そこまでしなくってもCytosol（膜もふくめた）を回収して反応させてもできなくはないと思います。あまり深く考えなくても混ぜれば（酵素とあなたの物質が接触すれば）、反応すると思えばいいです。

(無題) 削除/引用
No.9349-4 - 2020/12/04 (金) 12:07:00 - FB
＞Tracker様
コメントありがとうございます。
やはりLC-MSですかね、、、
切断されたものの解析には適すると思うのですが、恐らく切断されていないと思うので、むしろ切断されていないことを示したいと考えています。
そうすると、LC-MSでの検出は難しくなるので、何か良い方法がないか検討しているところです。
細胞抽出液のLC-MSを測定されたことがありますか？切断されると分子量が500程度になるはずなので、夾雑物のピークに埋もれてしまう可能性があるのかなと心配しています。。。


＞おお様
コメントありがとうございます。
先にも述べさせていただきましたが、どちらかというと酵素カクテルの系を試したいと思っています。
ただ、消化酵素のカクテルなどは市販品もなさそうなので、やはり自分で抽出してきて、BSAなどのタンパク質をコントロールにして比較するのが良さそうですかね、、、なかなか厳しそうですよね、、、

(無題) 削除/引用
No.9349-3 - 2020/12/04 (金) 02:08:02 - おお
外れるかはずれないかぐらいなら、細胞内から抽出したその化合物を液クロとかで分析すればわかると思うけど。

＞エンドソームをキットで単離して、得られた消化酵素カクテルから試験管内で分解の有無確かめることなどを妄想してみましたが

その発想はありだと思います。

(無題) 削除/引用
No.9349-2 - 2020/12/03 (木) 19:58:44 - Tracker
LC-MSとかですかね
メタノールに溶けるなら細胞ごとメタノールに溶かし込んでラフに除タンパクして、、

エンドソームでの化合物の分解 削除/引用
No.9349-1 - 2020/12/03 (木) 15:04:05 - FB
いつも拝見させていただいてます。
皆様からアドバイスをいただきたく、トピックを立てさせていただきました。

ある化合物をある担体にアミド結合で複合化して、ドラッグデリバリーを行っています。
この際、エンドサイトーシスよって細胞内に移行することまでは明らかにしていますが、エンドソーム内で化合物が担体から切断されているのかがまだ分かっていません。
化合物が担体から外れるのか、外れないのかが現在の研究のポイントになっています。
担体は消化酵素で分解されるものではなく、アミド結合なので、簡単に分解しないとは考えていますが、実験的にこれを確かめる方法にたどり着けていません（文献も当たっていますが、適切なキーワードが設定できていないものと思います）。
エンドソームをキットで単離して、得られた消化酵素カクテルから試験管内で分解の有無確かめることなどを妄想してみましたが、何か確かめる方法をご存じの方がいらっしゃいましたら、ご教示いただけると幸いです。
宜しくお願い致します。
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