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(無題) 削除/引用 No.9348-17 - 2020/12/04 (金) 18:55:56 - asan 血清フリーのメディウムにかえて1日ぐらい培養可能であれば、15cm dishぐらいで上清を回収後、TCAやアセトン沈殿やカラムで濃縮してWBは不可能ではないと思います。 ただ、分泌蛋白は通常は ELISAとかでやるほうが一般的かもしれませんね。 15cmでメディウム量をできるだけ下げて濃縮した上で、抗体でIPしたら上手く行く場合もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9348-16 - 2020/12/04 (金) 06:32:38 - おお まあ今までの常識だけですべてを否定するのは危険なのでその試みを否定するわけではないですので、数ある研究方針の中の一つの方向性として実験するのを止めるつもりはないです。でもある程度確実なアプローチをしないと認められないだろうという気はしています。

(無題) 削除/引用 No.9348-15 - 2020/12/04 (金) 05:00:19 - ii そのタンパク質のアミノ酸配列を見て、分泌が期待されそうな様子なのでしょうか？ おおさんの仰るように、そもそも分泌が期待されそうにない配列をしていて、それが上清に、更にアクチンと共に検出されたと言われたら、普通最初に考えるのは単に壊れた細胞から漏れ出ただけでは？ということだと思います。

(無題) 削除/引用 No.9348-14 - 2020/12/04 (金) 01:44:19 - おお >特異的抗体で蛍光染色した細胞像を見たところ、どこと断言できなかったものの、細胞質に全体的に反応があったので、分泌されているのではと考えて上清を調べております。 細胞全体と言うなら、細胞質などにも発現しているということでしょう。ごく一部例外を除いて分泌されるものはER、ゴルジ、Microsomeなどを経て分泌されるので、細胞全体で発現しているということをもとに分泌しているとは言えないと思います。 あなたは上清からアクチンが検出されているので、あなたの蛋白が検出されても分泌していると言う結論は疑わしいと指摘されるでしょう。 まずは分泌されているかどうかよりもその蛋白を同定するほうが良いのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.9348-13 - 2020/12/04 (金) 01:33:42 - おお >[Re:7] くろろんさんは書きました : > なので分泌タンパク質にも付着しており、タンパク質を流せているというコントロールになっていると考えております。 そんな話は聞いたことがないのだけど、

(無題) 削除/引用 No.9348-12 - 2020/12/04 (金) 00:33:26 - zcftγy７ 一般的には培養上清中のタンパク質は、細胞外マトリクスなど以外は濃度が半端なく低いです。増殖因子などがそういうものの代表です。濃縮もありかもしれないですが、膜に吸着してかなりロスしたりして思うようにならないことが多いです。また無血清培養でないと、FCS由来のタンパク質もも濃縮されて、泳動自体がものすごく乱れたり、非特異的なシグナルが多発したりしてどれが本物なのかなんだかわからなくなります。 ですのでこういう場合は通常はELISAで測定することが多いです。自分で抗原や抗体買ってELISA系を構築することはできます。

(無題) 削除/引用 No.9348-11 - 2020/12/03 (木) 21:50:33 - qq SDS-PAGEでサンプルバッファーの濃いSDSは、泳動フロントに泳動されます。 その近くに8kDaのbandがあると、ゲルから出てきても転写膜に吸着すること無く、流れ去っていくでしょう。 あなたの使っているゲルでは、8kDaのbandは泳動フロントよりも十分に遅く移動しているのでしょうか？ もしくは、SDS-PAGEしたあとのゲルを、転写バッファーで15分程度（長いだろうか？）リンスして、その後で転写するような試みもありかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.9348-10 - 2020/12/03 (木) 20:12:27 - mp 皆さんおっしゃっているように、まずアミコンでアルブミンなどを除き、その後 stratacleanレジンで濃縮する手もあります。IL-1のWBはこれでうまくいきました。

(無題) 削除/引用 No.9348-9 - 2020/12/03 (木) 17:26:44 - くろろん >ESの培養上清にその蛋白が存在することはすでに示されていますか？ 細胞のLysateからその蛋白の前駆体が検出される可能性はないですか？ >>脂肪細胞の培養上清での存在は示されていません。 特異的抗体で蛍光染色した細胞像を見たところ、どこと断言できなかったものの、細胞質に全体的に反応があったので、分泌されているのではと考えて上清を調べております。 lysateではバンドを確認しました。 たんぱく質沈殿法はやってみようと思います。 蛋白量でマスクされている可能性についてですが、actinのバンドが出ていなくてもその可能性はあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9348-8 - 2020/12/03 (木) 17:10:27 - くろろん ＞特異的モノクローナル抗体は作製してあるので、 ウェスタンで検出できないのにどうして特異抗体を作成できたのでしょうか？ 抗体作成に用いた抗原をウェスタンすると検出できるのでしょうか？ ＞＞培養細胞をマウスに注入し、出来た腫瘍から細胞を取り出しハイブリドーマを作製、スクリーニングを重ねることで抗体を作製できます。 その抗体がどんな抗原に反応しているのかを調べる研究です。 濃縮するよりも、30kDa以上を濃縮除去して、30kDa以下のろ液をTCA沈殿する方が良いかもしれない。 βアクチンが薄っすら出たといっていますが、ES細胞の培養上清を試料としてみたのであれば、細胞から漏れ出たACTBが薄っすら見えたということでしょうか？ ＞＞上清500µLを30kDaで濃縮後乾燥しましたが、ダメでした。 タンパク質沈殿法はまだ試していないので、参考になります！ 免疫沈降法はLysateではよりはっきりバンドが見えました。抗体量が限られているので、まだsupでは試していません。 転写条件等ですが、転写バッファーのメタノールは20％以上にすることは効果あると思いますか？(現在20%)

(無題) 削除/引用 No.9348-7 - 2020/12/03 (木) 17:03:55 - くろろん ＞ES細胞が分泌する蛋白の検出ですか。 説明が間違っておりました。ES細胞から分化させた脂肪細胞です。 ＞小胞体やゴルジ体中に存在する合成途中のものをポジコンとして検出するなり、組織由来の蛋白をポジコンで検出しないと抗体が悪いのか、サンプルが悪いのか、SDS-PAGE, Westernなど一連の検出過程が悪いのか判断できない。 同じゲルに流した、lysateから調整したサンプルでは検出できているので検出系はあまり問題ないのではと考えております。 ＞Actinは上清サンプルで検出されたのですか？おかしな話ですね。一部細胞が壊れて染み出たものを検出しているのか擬陽性のバンドを見ているのか不明で結局何のポジコンにもなっていない。 先生方の意見により、Actinはばらばらに存在するのではなく、各タンパク質に付随しているものと認識しています。なので分泌タンパク質にも付着しており、タンパク質を流せているというコントロールになっていると考えております。

(無題) 削除/引用 No.9348-6 - 2020/12/03 (木) 16:51:03 - おお ESの培養上清にその蛋白が存在することはすでに示されていますか？ 細胞のLysateからその蛋白の前駆体が検出される可能性はないですか？ 分解はされるかもしれませんが、そう考える証拠は揃っていません。 Sep-packという簡易カラムで精製して、乾燥させたあとにSDSPAGEに流す手はあるかもしれません。 https://www.biotech.cornell.edu/core-facilities-brc/facilities/proteomics-metabolomics-facility/protocols/c18-cartridge-solid-phase ちょっとサイズが小さいのでなんとも言えないですがTCAやアセトンを使って沈殿させるのも手かもしれません。やったことがないですがデオキシコール酸が沈殿する際のキャリアーとして使えるようですので添加するとより良いかもしれません。 すでに挙げられているアミコンウルトラの3kもやって見る価値はあると思います。 培地の蛋白成分はチェックしてますか？無血清でもBSAやフェリチンは添加されていると思いますし、場合によってはそういう蛋白のせいでSDSPAGEのキャパを超えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9348-5 - 2020/12/03 (木) 16:30:55 - qq ＞特異的モノクローナル抗体は作製してあるので、 ウェスタンで検出できないのにどうして特異抗体を作成できたのでしょうか？ 抗体作成に用いた抗原をウェスタンすると検出できるのでしょうか？ 濃縮するよりも、30kDa以上を濃縮除去して、30kDa以下のろ液をTCA沈殿する方が良いかもしれない。 βアクチンが薄っすら出たといっていますが、ES細胞の培養上清を試料としてみたのであれば、細胞から漏れ出たACTBが薄っすら見えたということでしょうか？ 免疫沈降法が選択肢だろうなと思うけど、まあ、何とかウェスタンが出ないことには、問題をより難しくするような気もします。 8kDaだと、SDS-PAGEの条件（Tricine-PAGEとか）や、転写の条件（PVDF膜や転写バッファー）も問題になると思います。

(無題) 削除/引用 No.9348-4 - 2020/12/03 (木) 16:28:49 - み ES細胞が分泌する蛋白の検出ですか。 小胞体やゴルジ体中に存在する合成途中のものをポジコンとして検出するなり、組織由来の蛋白をポジコンで検出しないと抗体が悪いのか、サンプルが悪いのか、SDS-PAGE, Westernなど一連の検出過程が悪いのか判断できない。 Actinは上清サンプルで検出されたのですか？おかしな話ですね。一部細胞が壊れて染み出たものを検出しているのか擬陽性のバンドを見ているのか不明で結局何のポジコンにもなっていない。 8kDaの蛋白が保持されるメンブレンを使用しているのかも怪しい。

(無題) 削除/引用 No.9348-2 - 2020/12/03 (木) 15:42:19 - noname 目的としているタンパク質がそうだとは断言はできませんが、 熱に弱いタンパク質は多いので乾燥中に分解された可能性はおると思います。 濃縮するのであればアミコンウルトラの3kを試されてはいかがでしょうか。

培養上清に含まれる低分子をウエスタン法で検出したい 削除/引用 No.9348-1 - 2020/12/03 (木) 14:40:14 - くろろん ES細胞を培養した上清から、目的のたんぱく質(8kDa)をウエスタンブロッティング法(以下、WB)で検出したいです。 特異的モノクローナル抗体は作製してあるので、それを1次抗体として何度かWBを実行しましたがバンドが出ません。 先行研究では、上清を凍結乾燥させてから行ったらバンドが出たという話を聞いたのですが、今所属している研究室に凍結乾燥機は無いので違う方法を模索しています。 凍結をしない普通の遠心バキューム式乾燥機で500µLを濃縮してWBしたこともありますが、目的タンパク質のバンドは出ず、コントロールとして用いたβ-actinのバンドはとても細く薄かったです。乾燥させてペレット状になった時に、少し熱くなっていた(40℃くらいに感じた)ので、たんぱく質が分解されたなどは考えられますか？ また、培養上清を用いたWBのサンプル調整法を知っている方がいらっしゃいましたら、ご教示ください。

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