全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.934-11 - 2012/09/21 (金) 23:39:11 - れな おお様　mon様 ご返信ありがとうございます。 PCRのアニーリング温度・時間・サイクル数なども関係ありそうです。 もう一度条件について検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.934-10 - 2012/09/21 (金) 04:24:21 - おお 少しアニーリング温度をあげるかなぁ。。。それとアニーリング時間を長めにすると特異的なアニーリングが安定することがあるようです。長いプロダクトが多すぎる印象でしたら、伸長反応時間を減らす方がいいかもしれません。プライマーの量、酵素の量なども減らす方がきれいに行く場合がまあまああるのではとおもいます。マグネシウムはバッファーに含まれてますでしょうか?私はあまりいじらないのですが、たまにサンプルのキャリーオーバーだけのマグネシュウムで辛うじてかかってておかしいおかしいと言っている人もいましたので。 リベッティブな配列なので出来上がったプロダクトがきれいな二本鎖になってない場合もあるかと。サンプルをエイどうの前に60-70度ぐらいに持ち上げて室温に放置か、70度ぐらいの水の入ったビーカ-にいれて、水が室温あたりに下がるまで待つかすると良いかもしれません。 直感的な回答ですけどね、、、

(無題) 削除/引用 No.934-9 - 2012/09/20 (木) 19:05:24 - mon PCRのサイクル数を減らすのは、どうだろうか。 長い産物ほど繰り返し配列のせいでreanealingが不完全になり一本鎖DNA部分が生じて、泳動が乱れるのでは、と考えました。PCR産物濃度が高いと起きやすいとか。

(無題) 削除/引用 No.934-8 - 2012/09/20 (木) 10:56:43 - れな おお様 ご返信ありがとうございます。 PCRの酵素は付属のものが無いため、説明書通りにTaqを使用しています。 PCRなど、いろいろ条件を変えて試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.934-7 - 2012/09/19 (水) 00:47:33 - おお なるほど、たしかにPCRの条件とか振った方がいいかもしれません。まシーンによってぶれるということは言われていますので。 PCRの酵素はキットについてくるのでしょうか?ならばそのロットで変なことがなかったか問い合わせてみるのは手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.934-6 - 2012/09/18 (火) 18:16:56 - れな mon様 ご返信ありがとうございます。 EtBrまたはSYBR Goldで後染めをしているので、染色には問題は無いのではないかと考えております。

(無題) 削除/引用 No.934-5 - 2012/09/18 (火) 18:11:20 - れな ~様、おお様 ご返信ありがとうございます。 プライマーダイマーはPCR、バンドの分離は泳動に問題があるのではないかと考えております。また、長鎖の部分のバンドに関しては、発光の強度も弱いのも原因ではないかと考えております。 マーカーですが、同等サイズのものは無いのですが、100bp以上のバンドはきれいに出ています。 ちなみに、ゲルの濃度は12%ポリアクリルアミドで、泳動は50Vで流しています。 プライマーダイマーは50~100bpのもので、インターナルコントロールのバンドは、しっかり出ています。ネガコンは、Bufferおよびヒト線維芽細胞になります。 バンドがスメアーになりにくい方法があれば良いのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.934-4 - 2012/09/18 (火) 17:24:10 - mon EtBr後染めで解決したりしないかな？

(無題) 削除/引用 No.934-3 - 2012/09/18 (火) 14:51:18 - おお 今のキットって、PCRが阻害されたり、うまくいってないかを確認するためのインターナルコントロールのバンドが出るようになってなかったっけ。。。 プライマーダイマーってもしかしてインターナルコントロールじゃないよね。。。 長くなるほど解像度が悪くなるので(ゲルにもよるけど)上の方にいくほどバンドの間隔がつまってきてスメアーに見れることはあるとおもいます。ゲルのできばえ、シグナルの強さに依存するのだとおもいますのでいつも典型的なイメージになるとも限らないかもしれませんよ。 サンプルにRNaseなどを加えてから反応させるとかネガコンを取れば活性がはかれているかどうかはっきりすると思いますが、おかきになっているネガコンはそういうネガコンでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.934-2 - 2012/09/18 (火) 10:54:16 - ~ >PCRの条件や泳動の条件など、特に気をつけた方がよいところなどありますでしょうか？ PCR部分の問題なのか、泳動部分の問題なのかがまだ切り分けられていないように見受けられます。 同等サイズの分子量マーカーは適切に分離されているのでしょうか？

テロメラーゼ活性がうまく測れない・・・ 削除/引用 No.934-1 - 2012/09/15 (土) 18:04:58 - れな 細胞のテロメラーゼ活性の測定をTRAP(telomeric repeat amplification protocol) assayでしているのですが、説明書の例のようなきれいなバンドが出ず困っています・・・ 具体的にですが、 6 bpごとのバンドが最初の50 bpから数本(3~4本)はある程度見えているのですが、それ以上の長鎖のバンドが完全にボヤけてしまっています。 あと、プライマーダイマーもネガコンで少し出てしまうことがあります。 PCRの条件や泳動の条件など、特に気をつけた方がよいところなどありますでしょうか？ その他、上記以外のことでもTRAP assayをする上でのコツなどがありましたら、ご教授していただければ幸いです。 周りに詳しい方が居なくて、お手上げ状態なので・・・ よろしくお願いいたします。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---