はじめまして。有機合成を行っていましたが、目的化合物を合成したのでアッセイ用に酵素を発現精製することになりました。
BL21 de3にトラフォメするにあたり、実験の勝手が違うためかなり気を付けて実験操作をしました。10 uLのコンピにプラスミド0.5 uLを加えて氷上5分, 45Cで40秒, 氷上2分, 40 uLのLBで回復培養30分, 計50 uLの溶液を抗生物質入りの寒天培地に塗布しましたが、24時間経過してもコロニーができません。
抗生物質はテトラサイクリン12 ug/mL、ベクターはpAlterに377残基のたんぱくなどを挿入しています。コンピは買ったやつをそのまま使いました。当研究室はプラスミドを設計できないので、5年前の先輩が大量に作ったプラスミド(-30C保存, 109 ng/uL)を用いました。
その昔はできていたそうですが、コツなどが先生の異動があって全く伝わってきていません。ラボでトラフォメのプロトコルがないのですが、教科書, CSH, 似たようなラボでのプロトコルと見比べてもどこが問題点かわからず、行き詰っています。現在は別の先輩が同じようにやってもうまく生えないこともあり、そもそもの実験系に疑問を抱いたため本フォーラムに投稿することにしました。
初心者ですが、通常のトラフォメはこんなに難航するんでしょうか。先輩は20時間で生えたと言っていましたが、抗生物質の半減期などを考えればそれを選択するのはどうなんだろうとも思っています。B4ですが卒論までに結果出せるか不安です。
また、生物実験のプロトコルは日々進化していると聞き、異なるやり方などあればご教授ください。EPは機材の関係で無理です。
何卒よろしくお願いいたします。 |
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