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(無題) 削除/引用 No.9325-13 - 2020/11/27 (金) 11:57:22 - 774 HEKやHeLaのような剥がれやすい細胞だとトリプシンなしでもいけますね。 ピペットで培養液orPBSをかけながら剥がして、ピペッティング。 これでもそんなに塊にはなりません。

(無題) 削除/引用 No.9325-12 - 2020/11/26 (木) 22:50:52 - qq 植え換えの簡単な293細胞ですが、トリプシン（？）で浮遊させた細胞が塊になるのは、トリプシン処理の時間が短すぎるときと、トリプシン処理が長過ぎるときの両方で起こります。 私は、dishを傾けると細胞が映画の「マトリックス」のように（？）剥がれ始めるところで、すばやくピペッティングして、そのまま数滴を新しい培地の入っているdishに植え込み、新しいdishで懸濁します。 トリプシン中で長く放っていたり、オーバーコンフルエントになってしまった細胞だと、剥がれた細胞の一部が溶解して、内容物（DNA?）が出てきて、周りの細胞を絡めて塊になります。これは、ピペッティングしてもばらばらにはなりません。 HepG2やA431などガチガチの細胞は、トリプシンでしばらく温めて前処理して、新たなトリプシンで分散するのが良かったような気がします。 いずれにしても、ピペッティングで分散するタイミングが大切だろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.9325-11 - 2020/11/24 (火) 13:51:46 - MAC5 ついでなので、みなさんに、お聞きしたいのですが、トリプシナーゼ処理後、細胞が一部塊になってしまうことも偏りの原因だと思います。みなさん、どのようにほぐしてますか？単純にピペッティング操作の問題でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9325-10 - 2020/11/24 (火) 13:03:17 - TS ＞攪拌してから混ぜています 攪拌してから播種しています。 すみません。。。

(無題) 削除/引用 No.9325-9 - 2020/11/24 (火) 08:37:58 - TS 播種してから攪拌するのではなく、攪拌してから混ぜています。たぶん経験値が低くてもうまくいきやすい方法です。 たとえば、15mLのチューブに培地10mLをいれて、播種すべき細胞数（0.2 x 10^6とか）を入れる。転倒攪拌でよく混ぜる（ここで均一な細胞液にする）。すぐにDishに全量うつし、すぐに何もせずCO2インキュベータ内に移す。あとは細胞は勝手に沈んで偏りなく接着します。

(無題) 削除/引用 No.9325-8 - 2020/11/24 (火) 07:26:05 - ii 経験的にはディッシュを揺するとむしろ分布が偏ると思っているので、細胞を含む培地をディッシュに加え、少し傾けるなどして底面全体に培地が行き渡ったら、そのまま触らずにしばらく静置してます。再接着の早い細胞だと10分くらいで底面にくっつき始めるので、それをインキュベーターに戻します。 接着が遅い細胞の場合、もっと長時間静置するか、底面を100 ug/ml poly-L-lysineなどで処理してディッシュ側の接着性を高めたりしています。

(無題) 削除/引用 No.9325-7 - 2020/11/23 (月) 04:45:52 - あの 細胞をゆするという発想そのものをやめてみたら？ たとえば、 細胞懸濁液を滅菌チューブで多めに調整して、ディッシュに、“の”の字を書く様に ディスポピペットで入れる もっとも、目的次第では、割り切って、偏りを気にしない

(無題) 削除/引用 No.9325-6 - 2020/11/22 (日) 21:17:15 - あおい 縦10回揺らす→1-2秒静置→横10回揺らす→1-2秒静置 を３回行うようにしています。 斜めに揺らすという動きがもしかしたら、外側に遠心力が加わるような回転の動きになっているのではないでしょうか？ あと、縦の揺らしのあとに波を整えないと当然外側に過剰に力が加わります。 それと培養液を揺らすと言うより中の細胞を揺らすような加速度がかかる手首のスナップをきかせるみたいな動きも重要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9325-5 - 2020/11/22 (日) 17:30:59 - vβhjいお 液量がかなり少なすぎるのではないかと思います。毛細管現象による凹面メ二スカスの形成で縁の方が培地の体積がおおきく、中央が小さいということになるので、細胞もそれに見合った分布になるため、結果としてそうなるのではないかと思います。それでも接着の早い細胞ならばあまり目立たないのでしょうが、遅いものだとそうした傾向が目立つのだと思います。 １０cmーdishならば培地量は10ー14ml程度は必要と思います。 ベンチで１時間静置するという方法は初めて聞きました。仮にHEPESプラス培地を使用してるとしても、それによって起きるであろうことをいろいろ想像すると、自分的にはあまりしたくない方法だなあと思いました。

(無題) 削除/引用 No.9325-4 - 2020/11/22 (日) 16:31:47 - おお >他のコツとしては、30分位で細胞が大体接着すると思いますので、小一時間はベンチで静置して接着を待つと良いかもしれません。 培地が赤くなって（pHがあがって）しまうと思いますが、大丈夫でしょうか、、、 HeLa などならそれでも死なないとか、その後 培養しても増えるでしょうけど、相当生理的に負担がかかっているとおもいますが。 私ならインキュベーターにいれて、１分後ぐらいに前後左右にふります。厳密に１分とか言うのではなく、細胞が底に沈んでまだ接着してない状態のときということです。細胞の底にいるのでその状態で均一にしてやれば、均一になった状態のその位置で細胞がディッシュにつくので。

(無題) 削除/引用 No.9325-2 - 2020/11/21 (土) 21:58:31 - 研究医 培地の量が少なすぎると、表面張力で培地が端にもっていかれて細胞が偏ることがあると思います。10cm dishなら10mlは入れたほうがよいと思います。 それでも偏っているようなら、細胞懸濁液を入れた後に、軽くピペッティングをすると均一化すると思います。 他のコツとしては、30分位で細胞が大体接着すると思いますので、小一時間はベンチで静置して接着を待つと良いかもしれません。

うまく細胞がまけず、ディッシュ内に偏りが生じます 削除/引用 No.9325-1 - 2020/11/21 (土) 20:23:37 - ゆか HeLa細胞の培養を行っていますが、 細胞を均一に播種することができません。 100 mm dishの端の方にたまり、 中央が少なくなってしまいます。 dishに培地を入れたあと、細胞の懸濁液を 真ん中の方に入れ、縦(十)と斜め(✕)にゆらしています。 ずっと困っています。 みなさんはどうしていますか？

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