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(無題) 削除/引用 No.932-23 - 2012/09/19 (水) 01:56:33 - Atail こちらで頂いたアドバイスをもとに、低いコンフルエンシー（〜50%）の細胞でTFしたところ、素敵な発現レベルを再現することが出来ました。また確かにDNAに問題はありませんでした。 細胞の状態によってこんなにも違うのかと、大変勉強になりました。皆様のすべてのアドバイス、書き込みに改めて感謝しております（不親切な同僚ポスドクとの殺伐とした環境なので本当に助かりました）。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.932-22 - 2012/09/18 (火) 15:13:20 - おい チ○コって名前、やめなよ。 研究者として恥ずかしくないのか？

(無題) 削除/引用 No.932-21 - 2012/09/18 (火) 14:43:46 - チンコ おおさん ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.932-20 - 2012/09/18 (火) 14:29:09 - おお >branchedです。以下の論文に従ってボスが調製しました。所感があれば是非お聞かせ頂ければと思います。 >http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sita.200500073/abstract ちょっと余計なおせっかいかもと思いましたが、PEIによる遺伝子導入について総合的な話ができるようにとぴ立てました。そちらの方でまとめて議論などできればいいかと思います。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=942

(無題) 削除/引用 No.932-19 - 2012/09/18 (火) 14:10:49 - おお >[Re:18] Atailさんは書きました : > でも様々なprotocolに特筆されていないということは違ってもせいぜい１割程度とかそんなものでしょうか。 細胞、入れる遺伝子などによりケースバイケースなのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.932-18 - 2012/09/18 (火) 11:33:45 - Atail > そのpeiはbranchedですか？linerですか？peiにも種類があります。そしてペイのストックソリューションは簡単にはできませんよ？水に溶かせばいいってものではないです。そこの確認がしたいですね。peiの調製法について。 branchedです。以下の論文に従ってボスが調製しました。所感があれば是非お聞かせ頂ければと思います。 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sita.200500073/abstract > トランスフェクション試薬を入れっぱなしにするというプロトコールは最近増えてきていますね。おそらくトランスフェクションし続けることによって効率を上げたいということだと思いますがどれくらいよくなるのかなどはよくわかりません(じっさいにその手の試薬の売り文句として、毒性が低く長時間のTFが可能などとかかれて、TF試薬が入っている限りトランスフェクションは絶えず起こっているような印象を与えるような書き方をしています)。 > > よく入る細胞では数時間からオーバーナイトでバイチをかえてもじゅうぶん入っていることも多いというのはあるとおもいます。 毒性がないから培地交換が不要というのがまさに気になっておりまして、途中で（例えば12時間後とか）フレッシュな培地に入れ替えた方が結果として発現量が良くなったりするのかなぁと思ったりしています。でも様々なprotocolに特筆されていないということは違ってもせいぜい１割程度とかそんなものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.932-17 - 2012/09/18 (火) 00:11:12 - おお >[Re:16] チンコさんは書きました : > そのpeiはbranchedですか？linerですか？peiにも種類があります。そしてペイのストックソリューションは簡単にはできませんよ？水に溶かせばいいってものではないです。そこの確認がしたいですね。peiの調製法について。 そのへんはプロトコールをわたしはもっています。

(無題) 削除/引用 No.932-16 - 2012/09/17 (月) 23:52:08 - チンコ そのpeiはbranchedですか？linerですか？peiにも種類があります。そしてペイのストックソリューションは簡単にはできませんよ？水に溶かせばいいってものではないです。そこの確認がしたいですね。peiの調製法について。

(無題) 削除/引用 No.932-15 - 2012/09/17 (月) 15:17:11 - おお >[Re:12] Atailさんは書きました : > > ところで、TF試薬によるかと思いますが、培地中に添加されたDNAは、培地交換しない限りいつまででも取り込まれ得るのでしょうか？（TF後新たに生じた細胞が新たに培地中のDNAを取り込むことがあるか、ということです。） PEIはあまりしよう経験がありません。トランスフェクション試薬を入れっぱなしにするというプロトコールは最近増えてきていますね。おそらくトランスフェクションし続けることによって効率を上げたいということだと思いますがどれくらいよくなるのかなどはよくわかりません(じっさいにその手の試薬の売り文句として、毒性が低く長時間のTFが可能などとかかれて、TF試薬が入っている限りトランスフェクションは絶えず起こっているような印象を与えるような書き方をしています)。 よく入る細胞では数時間からオーバーナイトでバイチをかえてもじゅうぶん入っていることも多いというのはあるとおもいます。 > > また、今後細胞周期阻害剤やシグナル伝達系阻害剤、修飾核酸標識などを行う予定ですが、TF試薬との共存がまずい例も存在し得るのでしょうか？ 293Tなら抜いても十分発現が維持されているんじゃないでしょうか(48時間後ぐらいまでなら)。しかし細かいことになると実験で使うもの、見るものによってどのように影響するか分からない面もあるとおもいます。ご自身の系で確かめるのがいちばんかと。 私の感触では293で若干の増殖のスピードが落ちるという感触はあります。

(無題) 削除/引用 No.932-14 - 2012/09/17 (月) 14:40:36 - Atail > PEIのtoxicity見られますか？ > 少なくとも我々が条件検討した結果では質量比10:1でもっともHEKでの発現効率はよかったです。 > 細胞も全く死にません。 同僚ポスドクも、本来PEIはtoxicでは無いと確かに言っていました。 実は我がラボは立ち上がって間もないラボでして、ボスがPEI stock solutionを作ったのですが、最初は全くTFされないということがありました。再度作り直したPEIで今後使っていける程度のTF効率が得られましたが、「ややtoxicであるようだから使用量を減らした方がいい」というのは同僚ポスドクの意見です。私はもともと微生物屋で細胞の知識・経験がほぼゼロであることから、細胞培養に関してはほぼ彼に一任しております。そうゆう訳で、申し訳ないのですがこれ以上の情報がございません…。 ただ、opti-memの使用やDNA比など、大変有用な情報が得られたと感じております。すぐにでも、自分の中で再現性がとれ、且つうまく行く方法を確立したい所存です。

(無題) 削除/引用 No.932-13 - 2012/09/17 (月) 11:55:15 - チンコ PEIのtoxicity見られますか？ 少なくとも我々が条件検討した結果では質量比10:1でもっともHEKでの発現効率はよかったです。 細胞も全く死にません。 この時の条件は100mm dishに5 mlのscaleで、5 ug/ml DNAで調製して4-6 hrs OPTI-MEM1で発現させました。 お使いのDMEMは当然抗生剤freeですよね？ 発現効率はDMEMより、OPTI-MEM1です。 具体的にPEIのtoxicityはなにを見てそう思われたのか後学のために教えてください。

追加質問 削除/引用 No.932-12 - 2012/09/17 (月) 07:18:06 - Atail > 結構同じ名前の細胞でも、飼っている研究室によって条件、毒性がちがってくるので、どうなんでしょうかねェ。PEI濃度上げてみて毒性が出ないところを見るというのはてですけど。 > トランスフェクションリージェント薄すぎやない？あと血清もなくてもいいよ。 > なにより、dmemより、optimemiの方が発現量結構高いよ。 調べてみる限りPEI/DNA重量比は、2-5:1ぐらいに幅があるようでした。実は以前はDNA 5ugに対してPEI 25ug使っていたのですが、どうもややtoxicでありそう、ということを同僚ポスドクが発見し、以来18 ugで行っている次第です。 FBSは、確かに添加しているプロトコルの方が少ないようです。opti-MEMの使用も気にはなっていたのですが、DMEMより良い発現量が得られるという情報をここで初めて得られたので、次回使用したいと思います。 ところで、TF試薬によるかと思いますが、培地中に添加されたDNAは、培地交換しない限りいつまででも取り込まれ得るのでしょうか？（TF後新たに生じた細胞が新たに培地中のDNAを取り込むことがあるか、ということです。） また、今後細胞周期阻害剤やシグナル伝達系阻害剤、修飾核酸標識などを行う予定ですが、TF試薬との共存がまずい例も存在し得るのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.932-11 - 2012/09/17 (月) 06:24:37 - おお 結構同じ名前の細胞でも、飼っている研究室によって条件、毒性がちがってくるので、どうなんでしょうかねェ。PEI濃度上げてみて毒性が出ないところを見るというのはてですけど。 ベストの条件を探すという意味ではぜひそうしたほうがいいとおもいますが、はじめはうまくいっていたということですから、そのあたりはどうなんでしょうかねぇ。 まああまり最適条件からはなれた状況なら結果が安定しないことはあるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.932-10 - 2012/09/17 (月) 04:53:52 - チンコ > 10cm dish（8mL DMEM）で、PEI 18ug、DNA 5ugです。PEI/DNA混合溶液に450 uLのDMEM w/oFBSを混合し、15分静置したのち、50uLのFBSを添加しこれをプレートしています。 トランスフェクションリージェント薄すぎやない？あと血清もなくてもいいよ。 なにより、dmemより、optimemiの方が発現量結構高いよ。

(無題) 削除/引用 No.932-9 - 2012/09/16 (日) 01:25:08 - Atail > ベクターのバックボーンは何でしょうか？ > SV40 ori が入っていますか？ > トランスフェクションするDNAに、CMV-GFPやCAG-GFPなど、マーカーを > いれて導入効率をみてはどうでしょうか？ はい、p3xFLAG-CMVを使っています。そうですね、これほど再現性が悪いならば、きちんと修得できるまでGFPのTFを毎回行いたいと思います。 > PEIとDNAの質量比はいかほどでしょうか。 > 私はHEK293Tでその条件をオプティマイズしましたが、結構比率や培地、影響しますよ。 10cm dish（8mL DMEM）で、PEI 18ug、DNA 5ugです。PEI/DNA混合溶液に450 uLのDMEM w/oFBSを混合し、15分静置したのち、50uLのFBSを添加しこれをプレートしています。 > じゃあ一度コンディションを戻してみてはどうでしょうか。細胞数が必要であれば、最初の細胞数をふやさず、TF後の培養時間を伸ばしてはどうでしょうか。 なるほど、50%のときにTFし、48時間発現、等すれば良いのですね。試してみます。

(無題) 削除/引用 No.932-8 - 2012/09/16 (日) 00:42:56 - protein 私は細胞の問題も無視できないと思います。 特に経験が浅いうちは細胞の状態を良好なままに保ちつつ 継代を続けるのはそれほど容易でないと自分の経験からも思います。 特に293は結構性質が変わりやすい印象があります。 一番大元の凍結ストックから初めてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.932-7 - 2012/09/15 (土) 21:48:01 - Harmonia ベクターのバックボーンは何でしょうか？ SV40 ori が入っていますか？ トランスフェクションするDNAに、CMV-GFPやCAG-GFPなど、マーカーを いれて導入効率をみてはどうでしょうか？ ↑見ている「発現レベルのふれ」は、細胞に導入されたDNA量を反映して いるのか、導入量が同じで本当に発現量を反映しているのか、おおよそ を把握できます。

(無題) 削除/引用 No.932-6 - 2012/09/15 (土) 20:26:38 - チンコ PEIとDNAの質量比はいかほどでしょうか。 私はHEK293Tでその条件をオプティマイズしましたが、結構比率や培地、影響しますよ。 詳しく書いてみてください。

(無題) 削除/引用 No.932-5 - 2012/09/15 (土) 16:43:32 - おお >[Re:4] Atailさんは書きました : > 直輝様、おお様、ご助言大変有り難うございます。 > > 細胞密度、細胞の調子ですか、、。思い当たるふしが無きにしも非ずです。 > >そこで、60-70% confluencyの時を狙ってTFするようにしているつもりですが、「想定していた細胞数が得られない」というのが怖くて、高めの、もしかしたら80%程度の密度でTFしていたかもしれません。細胞回収時には培地の色がかなり黄色に近い色になってしまったこともありました。 じゃあ一度コンディションを戻してみてはどうでしょうか。細胞数が必要であれば、最初の細胞数をふやさず、TF後の培養時間を伸ばしてはどうでしょうか。 > > 293Tは細胞同士が重なっても増殖できる、そんなに気にしなくていいと聞いたことがあるのですが、これは本当でしょうか。最近はいちおう、細胞がぎちぎちの100%になる前の、まだ隙間が所々にある時に継代するようにはしております。 確かに増えてくると細胞の上に細胞が載ってきますが、単層で増えている時と細胞の状態がちがってきますので、それを繰り返すと細胞の性質も変わりやすいかもしれません。基本に忠実にしておいた方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.932-4 - 2012/09/15 (土) 16:32:15 - Atail 直輝様、おお様、ご助言大変有り難うございます。 細胞密度、細胞の調子ですか、、。思い当たるふしが無きにしも非ずです。 TFですが、コンフルエントなディッシュから1:10 splitし、24時間以上（〜30時間）経過後にTFし、30〜36時間発現させています。経験的に、TFする際のconfluencyが50%以下であるとTF後のgrowthが遅くなり、30-36時間の発現後に予定していた細胞数が得られないということがありました。そこで、60-70% confluencyの時を狙ってTFするようにしているつもりですが、「想定していた細胞数が得られない」というのが怖くて、高めの、もしかしたら80%程度の密度でTFしていたかもしれません。細胞回収時には培地の色がかなり黄色に近い色になってしまったこともありました。 293Tは細胞同士が重なっても増殖できる、そんなに気にしなくていいと聞いたことがあるのですが、これは本当でしょうか。最近はいちおう、細胞がぎちぎちの100%になる前の、まだ隙間が所々にある時に継代するようにはしております。

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