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(無題) 削除/引用 No.9314-15 - 2020/11/20 (金) 21:39:01 - sdより 文字化けしたらしいです SD わる　平均値　が変動係数　cv

(無題) 削除/引用 No.9314-14 - 2020/11/20 (金) 21:14:00 - sdより SDより変動係数を参考にしてます SD➗平均値 で一定の数値以上で足切り

(無題) 削除/引用 No.9314-13 - 2020/11/20 (金) 05:11:11 - おお 同じcDNAからのテクニカルTriplicateと言うことで回答していますが、かんたんにどれか除くかどうかという判断は難しいと思いますので、SDがいくら以上のときは、そのサンプルと他の必要最上限のサンプルでPCRをやり直すというぐらいの基準を持っているのが望ましいかもしれません。AppliedBiosystemのあるマシーンの取説ではSD０．３あたりを、ThermoFisherはSD０．１７あたりを基準に（おそらく一番は測りやすいサイクル数で）、正確に測れているかを判断できるというような記述をみます。 プラクティカルにどの程度適応できるかわかりませんけど。 たとえば自身で同じサンプルを６つぐらい試しに走らせてみて（もっと多くてもいいけど）、自身のスキルでどれくらいのSDで収まるのか見極めてそれを基準にして置くのも手なのかもしれません。Ct値にある程度依存するので３０以降はどれくらい３０未満はどれくらいとか決めないと行けないかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.9314-12 - 2020/11/18 (水) 23:44:22 - s sdの推定に大きな誤差がある(過大に評価するではない)というのと、真のsdより小さめの値が出るとの間に何か矛盾がありますか?

(無題) 削除/引用 No.9314-11 - 2020/11/18 (水) 21:43:06 - qq ＞n=3程度のサンプルサイズから推定されたsdには相当大きな誤差があるはず と、思うかもしれないけど、実際はsize=n-1として求めたsdは、真のsdよりも小さめの値が出てくるのです。それを母集団のsdと勘違いするから、実際以上に揃った値が出ても当たり前だと勘違いして、少し離れた値が出ると異常値だと誤解するわけです。

(無題) 削除/引用 No.9314-10 - 2020/11/18 (水) 10:02:43 - s 補足です。 > 自分でも、実験上あり得ない値(Ct値が5以上違うとか)でない限り、分析から外すことはしないと思います。 外れた値を除いただけで事足れりとすることはない、という意味です。原因がわからなければ、実験そのものをやり直すことはもちろんあります。 外れ値検定についてですが、n=3程度のサンプルサイズから推定されたsdには相当大きな誤差があるはずで、そのsdを元に各サンプル毎に外れ値を判断するのは危険だと思います。例えばGrubbs' testでは、外れ値候補以外の2つの値が偶然全く同一の場合、外れ値候補の値はどんなに近くても外れ値に判定されるはずです。異なったサンプルについての全ての値(それぞれのCt値平均との差)をプールしてsdを計算し、1.96σとか2σ、3σ以上離れているものを除くとしたほうがまだいいような。Ct値が大きく違うとsdも変わってくるのでちょっと困りますが。

(無題) 削除/引用 No.9314-9 - 2020/11/18 (水) 09:31:20 - たぷ dcfvgy様 外れ値を削除するのであれば、検定をしないといけないですね。

(無題) 削除/引用 No.9314-8 - 2020/11/17 (火) 19:43:31 - dcfvgy n=3だとどれが外れ値かを自分で判断すること自体非常に難しいと言うか、自分で決めていいのかどうかわかりません。ある程度、こうであろうと言う見込みで外れ値を選定する方法で対処されているのでしょうか。私は頭があまり良くないので自分で外れ値を見つけることができません。なので、とりあえず棄却検定して、統計ソフトに外れ値を教えてもらって外します。ただ棄却検定はサンプルサイズがそれなりに大きくないとできません。なのでn=3だと適用可能かどうかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.9314-7 - 2020/11/17 (火) 11:45:32 - たぷ おお様 再びありがとうございます。 検定のご紹介ありがとうございます。勉強になります。 自分が除外したものを、検定してみると、「有意差なし」となりました。 やはり、安易に除外するのはよくなさそうです。 ＞Ct値が大きいとブレ幅が大きくなりますし これについては、考慮していませんでした。 検量線用の段階希釈サンプルで、最も薄いサンプルはCtSDが0.3とか0.6など大きい値を示していたので、希釈系列を変えようかと考えていました。

(無題) 削除/引用 No.9314-6 - 2020/11/17 (火) 11:30:25 - おお 外れ値を検定することはできなくもないです。 Outlier testで調べるといいです。 https://www.graphpad.com/quickcalcs/grubbs1/ N=3など少ない場合はMisleadの原因になるようですけど。significance level を厳しく取ると多少は説得力があると思いますけど。 qPCRのテクニカルエラーとしてどれくらいが妥当かという議論はありますが、Ct値が大きいとブレ幅が大きくなりますし決まった値を設定するのはちょっと無理かもしれません。また、スキルなどの要因でどのくらいブレるのかもわかりませんし。

(無題) 削除/引用 No.9314-5 - 2020/11/17 (火) 11:26:09 - たぷ s様 ありがとうございます。 外れ値除外というのは、意図的でありますので、判断が難しいです。 確かにCtが５違うなど明らかなもののみにした方がよいでしょうか。 n数などについても、引き続き、皆様のご意見を伺いたく存じます。

(無題) 削除/引用 No.9314-4 - 2020/11/17 (火) 11:03:55 - s つい最近奥村先生のこういうツイートを見ました。 https://twitter.com/h_okumura/status/1327840635362045953 自分でも、実験上あり得ない値(Ct値が5以上違うとか)でない限り、分析から外すことはしないと思います。

(無題) 削除/引用 No.9314-3 - 2020/11/17 (火) 10:23:29 - たぷ おお様 早速のご回答ありがとうございます。 平均値を使用していますが、外れ値は除外した方がよいかなとも思いました。ただn=2になるとサンプル数が少ないようにも思うので、除外する場合があることを考慮してn=5でやることも考えています。サンプル数が増えるので手間ですが。。 外れ値の判断基準についてはいかがでしょうか。ご意見いただけますと有難く存じます。

(無題) 削除/引用 No.9314-2 - 2020/11/17 (火) 10:07:46 - おお >また、n=3で解析していますが、３サンプルのばらつきとしてCt値が0.3くらいずれているものを除外しています。 ３つあるなら全部使って平均すればどうかな。

qPCRの閾値と外れ値について 削除/引用 No.9314-1 - 2020/11/17 (火) 09:41:45 - たぷ qPCRを最近始めました。皆様の解析方法をご教授いただけますと幸いです。 ABIのStepOneを使用しています。 SYBRで相対定量をしています。 スレッショルドラインは、自動計算を使用しており、CtSDが大きいものは外れ値と判断しています。目安として＜0.1程度なら問題ないと捉えていますが、この判断は正しいでしょうか。 ＜0.1の値には特に根拠はありません。全体的な結果を見てこの程度なら問題ないと判断しました。 また、n=3で解析していますが、３サンプルのばらつきとしてCt値が0.3くらいずれているものを除外しています。これについても目安のようなものがありましたらご教授いただけますと幸いです。 その他、結果の良悪を判断するための、指標等あれば教えていただけますでしょうか。よろしくお願いいたします。

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