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(無題) 削除/引用 No.9306-2 - 2020/11/16 (月) 10:33:49 - seventh クローニングせずにPCR産物を読んで波形を見てみたらどうですか。

バイサルファイトシークエンスのサイクル数 削除/引用 No.9306-1 - 2020/11/15 (日) 01:12:53 - こにー 最近、DNAのメチル化解析のためにバイサルファイトシークエンスを始めたものです。 バイサルファイト処理後のゲノムDNAを用いてPCRを行うと思いますが、一般的にこの時のサイクル数はどの程度が一般的なのでしょうか？ と言いますのも、PCR産物をTA cloningした後、各サンプル5-6クローンをシークエンスすると全て同一の配列の場合があります。 メチル化DNAが均一であるという解釈もできますが、PCRによるバイアスがかかっている可能性も懸念しています。 バイサルファイトシークエンスの経験が豊富な方で、「PCRのサイクル数」と「得られるデータの違い」を知っていましたら、ご教授して頂けたら幸いです。 宜しくお願い致します。 ---------------------------------------------------------------------------- サンプルはマウス由来の細胞をin vitroで薬剤処理群、未処理群を用いています。 PCRはKOD -Multi & Epi-®を用いて行い、1stPCRで増幅が無い場合は、nested PCRを行なっています。 また、配列をシークエンスで確認したサンプルのCpG配列以外の「C」は、ほぼ全て「T」に置き換わっています。

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