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U6promoterを用いた短鎖RNAの発現について トピック削除
No.9288-TOPIC - 2020/11/09 (月) 19:08:19 - でつ
U6promoterを用いて20bpほどの短鎖RNAを発現させたいのですが
設計としては

U6promoter-NNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNTTTTTT

で設計すればNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTが発現するということで大丈夫でしょうか？
なにか設計で間違っているところがあれば教えていただけると幸いです。

また短鎖RNAの発現を確認する方法があれば教えていただけると幸いです。
　
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No.9288-6 - 2020/11/16 (月) 14:28:53 - でつ
みなさんありがとうございます

pSIrenからU6promoterをクローニングしbamH1サイトの下流に目的の配列を組み込んであります。
またU6promoterの中にTATAboxがあり目的の配列はちょうどTATAboxから下流のちょうど23bpに目的の配列の最初のGがあるので大丈夫そうです。

(無題) 削除/引用
No.9288-5 - 2020/11/11 (水) 13:32:18 - toto
専門家じゃないですが、ちょっと違うような。。。U6等typeIII promoterの開始点はTATA boxから23base以降の最初のＧと普通されてると思います。ただこれもその周辺配列でちょっとずれるという論文もあります。
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4040628/

それでおそらくでつさんの書かれているU6promoterというのがTATAを含むのであれば、もう少し下流が開始点になるのじゃないかな。

(無題) 削除/引用
No.9288-4 - 2020/11/11 (水) 08:01:12 - おお
>[Re:3] でつさんは書きました :
> GCTATGTGAGATTAAGTTATTTTTTTを短い鎖RNAとして発現させたいです。ターミネーター配列や最初の数塩基は削れても構いません。また前方数塩基多くても構いません。
>
> pEGFP-C1のMCSとは関係ない部分にU6 promoterを挿入し
> U6promoter-GGATCC-GCTATGTGAGATTAAGTTATTTTTTTとしました。
>
> GGATCCはu6をpSiren-retroQからPCRでクローニングする時にある程度外側に余白を持たせた時の残りです。

GGATCCはpSiren-retroQのクローニングサイトですよね。以下のURLによるとBamHIのCCのあとのGから転写が始まるようです。

http://www.dartmouth.edu/~tonyz/Retroq.pdf

(無題) 削除/引用
No.9288-3 - 2020/11/10 (火) 12:40:30 - でつ
GCTATGTGAGATTAAGTTATTTTTTTを短い鎖RNAとして発現させたいです。ターミネーター配列や最初の数塩基は削れても構いません。また前方数塩基多くても構いません。

pEGFP-C1のMCSとは関係ない部分にU6 promoterを挿入し
U6promoter-GGATCC-GCTATGTGAGATTAAGTTATTTTTTTとしました。

GGATCCはu6をpSiren-retroQからPCRでクローニングする時にある程度外側に余白を持たせた時の残りです。

(無題) 削除/引用
No.9288-2 - 2020/11/10 (火) 05:02:09 - おお
多分間違っていると思います。実際にどのようなプラスミド（Construction）なのか明示できませんか？

U6promoterを用いた短鎖RNAの発現について 削除/引用
No.9288-1 - 2020/11/09 (月) 19:08:19 - でつ
U6promoterを用いて20bpほどの短鎖RNAを発現させたいのですが
設計としては

U6promoter-NNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNTTTTTT

で設計すればNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTが発現するということで大丈夫でしょうか？
なにか設計で間違っているところがあれば教えていただけると幸いです。

また短鎖RNAの発現を確認する方法があれば教えていただけると幸いです。
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