BioTechnicalフォーラム [qRT-PCRの解析方法について]

qRT-PCRの解析方法について

No.9286-TOPIC - 2020/11/08 (日) 03:59:34 - qRT-PCR初心者

qRT-PCRの解析方法についてご教授いただけませんでしょうか？
私はここ最近になりマウス組織におけるqRT-PCR解析を行っています。

mouseはdyingのKOマウスからRNAを取っていますが、複数のKOが同じ日にdyingになることはないので、RNAを回収し、qRT-PCRまでその日のうちに解析し終え、さらにその後にマウスがdyingとなれば同じことを繰り返しています。その際には当然、WTマウスからもRNA回収しています。

ただ、WTに比べ、KOではある遺伝子が再現性良く変化しますが、GAPDHで補正後のddCt値は各ペアともバラバラでp値が有意となりません。

そこで、実際のddCt値での比較はやめて、ddCt (KO)/ddCt (WT)値で行えば、おそらく有意なp値が出ると思います。その際のバーグラフの縦軸はrelative value of ddCt in KO to WTとなります。

ただ論文では実際のddCt値を縦軸に持って行ってるものが多く、もしかしたら全てサンプルを撮り終えた時点でqPCRを行なっているのでは？と思いました。やはりもう一度全サンプルを一度にqPCRするべきでしょうか？

わかりずらい書き方になっていたらすみません。
ご教示いただけるようでしたらとても嬉しいです。
よろしくお願いします。
　

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No.9286-14 - 2020/11/11 (水) 07:03:11 - おお

>[Re:13] qRT-PCR初心者さんは書きました :
> おお先生
>
> 重ねてお礼申し上げます。
>
> ＞Fold changeは(Wt dCT)/(Control dCt)ではありませんよ。
> 今まだここにつまづいています。
> まずは言葉の意味を誤って覚えていたことが一番の原因だと思います。
> すぐに理解してお返事します。短文で恐縮ですが、ありがとうございます。
>

http://www.science.smith.edu/cmbs/wp-content/uploads/sites/36/2015/09/Analyzing-your-QRT-for-relative-2%5E-%E2%88%86%E2%88%86Ct.pdf

https://bitesizebio.com/24894/4-easy-steps-to-analyze-your-qpcr-data-using-double-delta-ct-analysis/

(無題)

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No.9286-13 - 2020/11/11 (水) 02:57:58 - qRT-PCR初心者

おお先生

重ねてお礼申し上げます。

＞Fold changeは(Wt dCT)/(Control dCt)ではありませんよ。
今まだここにつまづいています。
まずは言葉の意味を誤って覚えていたことが一番の原因だと思います。
すぐに理解してお返事します。短文で恐縮ですが、ありがとうございます。

(無題)

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No.9286-12 - 2020/11/10 (火) 06:10:09 - おお

>Fold changeは(Wt dCT)/(Control dCt)ではありませんよ。そもそもFold changeを対数のメモリでだすのならdCt（wt）ーdCt（Control)すなわちddCtです。

Fold changeは(KO dCT)/(Control dCt)ではありませんよ。そもそもFold changeを対数のメモリでだすのならdCt（KO）ーdCt（Control)すなわちddCtです。

訂正がありました。すいませんでした。

(無題)

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No.9286-11 - 2020/11/09 (月) 12:32:29 - おお

ぐぐって実際のグラフを見るのは悪くないのですが、それよりも方法論を理解したいわけですから、そういうものを探して読むべきではないですか？多分試薬やさんのホームページとかにでも解説があると思いますよ。

(無題)

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No.9286-10 - 2020/11/09 (月) 12:27:41 - おお

>[Re:9] qRT-PCR初心者さんは書きました :
> おお先生
>
> いえ、それも先生の言葉をそのまま使用しただけです...

> WTやコントロールで比較対象の発現量を割り算をしてWTやコントロールのバーグラフを1に、比較対象のバーにのみエラーバーが付いているのをみます。なのでおそらく私と同じようなことをされてる方もいらっしゃるようで安心しました。たとえば以下のグラフです。
> https://www.researchgate.net/figure/Validation-of-gene-expression-profiling-by-RT-PCR-mRNA-levels-for-indicated-genes-were_fig2_6796762

Fold changeは(Wt dCT)/(Control dCt)ではありませんよ。そもそもFold changeを対数のメモリでだすのならdCt（wt）ーdCt（Control)すなわちddCtです。２のddCT乗で表せば直線的なメモリになります。このときはControlは１です。私が示したほうほうもControlは０でこれを直線的に示した場合は２の０乗で１です。

>
> ただ不思議なことに、WTやコントロールで1にも関わらず、その1にもエラーバーがついてるバーグラフを見つけることができます。これはどういうことでしょうか...たとえば以下のグラフです。

簡単に言うとControlの値の平均値を１としたばあいのそれぞれの値を出せばいいだけです。

平均するには３通りあります。
そのまま通常の平均をする（足して４で割る）。
幾何平均をとる（すべての積して４乗根をとる）。
直線的数字になおして平均値をとる。

(無題)

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No.9286-9 - 2020/11/09 (月) 08:46:43 - qRT-PCR初心者

おお先生

いえ、それも先生の言葉をそのまま使用しただけです...

”mrna expression researchgate pcr”でヤフりまして”画像”ボタンを押すと関連する画像が出てきます。
WTやコントロールで比較対象の発現量を割り算をしてWTやコントロールのバーグラフを1に、比較対象のバーにのみエラーバーが付いているのをみます。なのでおそらく私と同じようなことをされてる方もいらっしゃるようで安心しました。たとえば以下のグラフです。
https://www.researchgate.net/figure/Validation-of-gene-expression-profiling-by-RT-PCR-mRNA-levels-for-indicated-genes-were_fig2_6796762

ただ不思議なことに、WTやコントロールで1にも関わらず、その1にもエラーバーがついてるバーグラフを見つけることができます。これはどういうことでしょうか...たとえば以下のグラフです。
https://www.researchgate.net/figure/Real-time-RT-PCR-data-show-levels-of-gene-expression-in-response-to-losartan-treatment-at_fig5_248395559

今日、ノンパラの勉強をする予定です。
お付き合いいただき、重ねてお礼申し上げます。

(無題)

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No.9286-8 - 2020/11/08 (日) 17:12:47 - おお

>dying (死にそう)

なるほど。英語のワードのチョイスは正確ですね。留学中ですか？
あ、立ち入る必要のないことでした。

(無題)

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No.9286-7 - 2020/11/08 (日) 15:30:43 - qRT-PCR初心者

おお先生

再度ありがとうございます。
あと、本当にすみません。
私が記載した数値はすでにGAPDHで補正した後の相対的な発現量でした。
私が教えていただいてる方のdCt、ddCtという言葉を理解していませんでした。
すみません。

ある遺伝子のXの発現量はWTの一匹目で
0.135357411

KOの一匹目では0.031135807となり、

その発現量の差は割り算させてもらいますと0.230026615となり、WTに比べ、KOでは約23%しか発現していない、ということになります。同様に4匹分行うと、48%, 8.6%, 62%となります。

WT/WTは常に100%なので、 KO/WTの23%, 48%, 8.6%, 62%でT検定を行っていました。
初心者とは言っても既に何度も実験をさせてもらっているので自分の理解不足が招いた問題です。
本当に困惑させてしまい申し訳ないですし、お恥ずかしいです。
もう一度言葉の意味からきちんと勉強します。

あと、dying (死にそう)なマウスから組織をとりますが、既に死んでしまったマウスからは取ってはいません。たくさんのご指摘をいただき、ありがとうございました。一から勉強します。

(無題)

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No.9286-6 - 2020/11/08 (日) 13:59:43 - おお

>そこでWTのdCTをWTのdCtで割ってみると、その値は当然4ペアとも
1 1 1 1となり、

割るのは明らかにおかしいですし、その数字で通常のT-testは明らかに無理です。

また、ddCTが大きくても０．１程度、直線的な数字にするとコントロール１（＝２＾０）にたいして０．９３（＝２＾ー０．１）程度。これを持って差があるというのがどの程度説得力があるのか、、、

まあ可能性を全ては否定しませんが、これを持って主張が通るかよく考えてみてください。
いろんな計算方法があるのだけど、
WTの一番目とKOの一番目がペアーでやった実験と察します。その場合
一番目のddCtは-0.104221604
２番目-0.039361573
３番目-0.103362206
４番目-0.079085842

ControlのddCtは必然的に０。
０に対して上記ddCtをOne sample T-testで計算すればp＝0.012712687
（One sample T-Testはある基準値から有意に外れたところにあるかを見る検定法）
まあ一見良さげに見えますが
直線的な数字に変換すると
Controlは２＾０＝１
KOは２のddCT乗で
0.93120269
0.934576986
0.917459603
0.996837135

Controlの１に対してOne sample T-Testをするとp＝0.052780894とほんとに微妙です。

あと実験のデザインもちょっと不思議だけど（無理があるけど理想的な実験系が不可能な場合もあるのでだめと言いきれませんけど）、もう少しやりようがないのかなと思います。お考えの仮説がどのようなものかわかりませんので、こういったデザインがいいとかまで言えませんけど。死んだマウスの組織とか、時間とともにどんどん変化していくとは思いますが、そのへんも結果に大きく作用する要因ですし。

(無題)

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No.9286-5 - 2020/11/08 (日) 11:57:39 - qRT-PCR初心者

実際のdCt値は、WTでは
0.135357411 0.075715665 0.113047422 0.20848423669867

KOのdCT値は
0.031135807 0.036354092 0.009685216 0.12939839454532

となり、各N=4で行なっています。
この状態でエクセルのTTESTを行うとp = 0.0790となります。

そこでWTのdCTをWTのdCtで割ってみると、その値は当然4ペアとも
1 1 1 1となり、

KOのdCTをWTのdCtで割ってみると、その値は
0.230026615 0.480139631 0.085673925 0.620662725

すみません、スペースが消えてしまいましたので再度投稿させていただきました。

(無題)

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No.9286-4 - 2020/11/08 (日) 11:55:39 - qRT-PCR初心者

あのさん、おおさん、ご回答いただき感謝しています。

おおさんのおっしゃられる通り、私のddCtはdCtのことでした。
誤記を失礼しました。

実際のdCt値は、WTでは
0.1353574110.0757156650.1130474220.20848423669867

KOのdCT値は
0.0311358070.0363540920.0096852160.12939839454532

となり、各N=4で行なっています。
この状態でエクセルのTTESTを行うとp = 0.0790となります。

そこでWTのdCTをWTのdCtで割ってみると、その値は当然4ペアとも
1 1 1 1となり、

KOのdCTをWTのdCtで割ってみると、その値は
0.2300266150.4801396310.0856739250.620662725

となり、この状態でエクセルのTTESTを行うとp = 0.00173となり統計学的に有意になります。
このような操作は受け入れられるものでしょうか？というのが質問でした。わかりにくくて、すみません。

これをグラフに取ると、
WTは4マウスとも1を示し、KOは4つのドットが程度の差こそあれ1よりも下にきます。

あの先生やおお先生がご指摘くださいましたノンパラメトリック検定というものはここで初めて知りまして、自分の無知を自覚しました。まずは勉強を行ってみます。
今揃っている4つのペアのcDNAでやり直してもよいのですが、今後ますますNが増えることを考えると何度もやり直すのはcDNAサンプルにも限りがあるので難しいように感じています。
たくさんのアドバイスをありがとうございます。

(無題)

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No.9286-3 - 2020/11/08 (日) 05:32:46 - おお

まず何やっているのか質問文から全く想像できません。

GAPDHで補正した値はdCtですよね。例えばWTのdCTとKOのdCTの比較はその差、ddCtで表しますよね。だからddCt (KO)/ddCt (WT)って計算できるかどうか不明ですが、正規分布をいがめるような計算処理は統計処理が適切かどうか疑問視されても仕方がないです。それよりもばらつきがある場合はnを稼いでノンパラで処理したほうがStraightforwardです

実際のCt値（仮の数値でもいいけど）を書き出してみたらそこから計算方法を示唆できるかもです。

＞全サンプルを一度にqPCRするべき

それはあなたの手技の問題で、違う人がやればそれは必要なかったりもするのでなんとも言えません。今揃っているサンプルで一度にやってみて確認すればどうですか？

(無題)

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No.9286-2 - 2020/11/08 (日) 04:53:31 - あの

少なくとも、既報で使われるハウスキーピングジーンの検討が必要
どうしてgapdh か？

また一つつだけでなく二つ使う

スタンダード法も実施してみる

その上で適切に統計解析、特に、正規分布してるか調べる検定し、
分布は均一かF検定して、パラメトリックかノンパラか選択する

qRT-PCRの解析方法について

削除/引用

No.9286-1 - 2020/11/08 (日) 03:59:34 - qRT-PCR初心者

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