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(無題) 削除/引用 No.9267-10 - 2020/11/02 (月) 09:02:42 - Ｍ１　女 G25様 詳しく説明して下さってありがとうございます。理解できました！ なぜ熱失活がダメなのかずっと疑問でした。ダメならばなぜ説明書に熱失活処理の手順を載せているのかな？と思ってましたがそのような理由があったんですねね！ gDNA removerの操作が簡単なのもわかりました。とても納得です。 BlueComma様 恥ずかしながらno-RT controlのことはすっかり忘れておりました。拝見して慌ててノートを読み返しているところです。 逆転写反応前のサンプルのＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにかけてみるということですね。前回は(学部生の時)このステップは入れませんでした。2回もゲノム除去をしていたためと思われます。 少し方向性が見えてきて気持ちが落ち着いてきました。皆様のおかげです。ありがとうございます。 no-RT controlを実行し、ＤＮＡ由来のシグナルがないようであればそのままMix with gDNA Removerで逆転写しようかなと。 昨年度実験を教えてくれたのはポスドクの人で今はいません。現在はその人に実験を教えてもらうことはできないのです。上の人、と書いたのは先生です。先生は実験の細かなアドバイスは無しです。周りの人、は他の研究室の学生さんです。

(無題) 削除/引用 No.9267-9 - 2020/11/01 (日) 19:34:50 - BlueComma M1 女　様、 ご存知だと思いますが、no-RT controlはされないのでしょうか？ RTの直前でサンプルの一部をno-RT controlで反応させ、PCRでゲノム由来の産物をチェックすれば、ゲノムDNAの有無が確認できると思うのですが、それでもDNAの残存が度々あったということでしょうか。それとも、万が一PCRの増幅がないのにもかかわらず定量に影響を及ぼす程のDNAの残留があるのであれば、当方としてもかなり重要な情報です。

(無題) 削除/引用 No.9267-8 - 2020/11/01 (日) 16:54:53 - G25 gDNA removerという商品名がついていますが、中身はDNase Iですよ。 その上で、必要性について考えてみれば？ DNase Iの熱失活処理は、Mg++, Ca++存在下では(そもそもDNaseの活性のため必要因子ですが)それらが触媒となってRNAを分解するので注意が必要です。十分なEDTAを加えてからやればいいですが、ダウンストリームの反応との兼ね合いが難しい。その点でPCI抽出が安全。gDNA removerの系は、次に加えるRTバッファーにDNaseを不活性化する成分(抗体かなんかでしょうかね)が入っているため、熱処理等が必要ないようになっているようです。

(無題) 削除/引用 No.9267-7 - 2020/11/01 (日) 14:06:31 - Ｍ１　女 おお様 ありがとうございます。 ＞それは貴方が使っているような材料でそういうことが起こったということなら＞ば、最初のDNase処理を省くという考え方がよくわかりません。 ステップ過多により帰宅できない可能性を上の人に訴えたところ、DNasea省略の助言を受けましてリバトラエースの説明書を読む限りでは省略しても問題ないのでは？と考えたことと、周囲を見渡すとwith gDNA Removerを使用している人はDNasea処理をしていないためです。おそらくはBlueComma様のように上手くいっているのだと思います。 しかし、注意を受けていますので定量に影響が出たらどうしようと踏み切れず、ここで相談させて頂いております。周囲は学生ばかりで長年にわたる経験者は少ないです。 おお様がアップして下さったアドレスを調べてみたところRNase-Free DNase Set(50)16000円を見つけました。カラム上でＤＮＡを分解できるようです。ただし、やはり高価なので購入できるかはわかりません。 シグマのは64400円(50)でした。DNase付属のは若干割高で(当然ですが)悩むところです。予算が厳しいようで辛いです。 アジレントはＨＰで説明は読めました。 まず、キアゲンのRNase-Free DNaseを調べて使えるようならば購入をお願いしてみる。 購入がダメだとなったら、やはりＤＮＡの残が恐ろしいので、 一日目でＲＮＡ抽出して冷凍する。 二日目にタカラDNaseIを利用してゲノム除去。その後リバトラエースマスターミックスwith gDNA Removerで逆転写。 植物は一日で逆転写までするように指導されましたがこれしかないかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.9267-6 - 2020/11/01 (日) 04:54:38 - おお >[Re:5] Ｍ１　女さんは書きました : > > おお　様 > > 2回もＤＮＡ除去の行程を入れるのは、残るケースがあるからと注意がありました。 それは貴方が使っているような材料でそういうことが起こったということならば、最初のDNase処理を省くという考え方がよくわかりません。 植物ではよくわかりませんが、カラム精製の途中でDNase処理をするキットも出回ってます。 QIAGENのWeb siteでも、 For certain RNA applications that are sensitive to very small amounts of DNA, the residual amounts of DNA remaining can be removed using convenient on-column DNase treatment during the RNeasy procedure. と書いてますし（方法の詳細はここには書かれてませんが） https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/rna-purification/total-rna/rneasy-plant-mini-kit/#productdetails シグマでたまたま見つけたやつだと、 DNase Treatment (Optional) This optional step is carried out if genomic DNA-free RNA is required. It is recommended that Norgen’s RNase-Free DNase I Kit (Product No. 25710) be used for this step. https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/plant-rna-dna-purification-kit.html あと随分昔ですけどアジレントはDNase処理をしなくてもqRCRに対応できる精製キットを目指しているといっていたような気がします。いまはそういう精製キットも出回っているかもしれません。そういうものだとgDNAの持ち込みは最初からかなり抑えられるかもしれませんので、gDNA Removerだけでもうまくいくのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9267-5 - 2020/10/31 (土) 20:48:19 - Ｍ１　女 BlueComma　様 ありがとうございます。BlueComma様は上手くいっているのですね。勇気づけられる返答でした。 DNaseIの行程を入れると朝8時から開始しても夜の10時過ぎまでかかります。系統数と反復が多いためです。先輩たちはそうしてきたようでした。しかし、私は住居が遠いため無理があります。 A　様 DNaseIの行程が入っているのはまさしくＡ様が書かれたようにＤＮＡが除去しきれなかったケースがあったからのようです。やはり残存が起こることがあるのですね。サポートの返答まで載せて頂いて感謝です。ありがとうございます。 悩むところです。 おお　様 2回もＤＮＡ除去の行程を入れるのは、残るケースがあるからと注意がありました。BlueComma様とＡ様のご意見が分かれているように、ケースバイケースかもしれません。 本来ならばDNaseIのあるなしで、発現量の違いをテストしてみるのが良いかもしれませんが、予算と時間の関係で予備実験は難しいです。 TAKARA のDNaseIでもHeat inactivation処理は可能でしょうか。TAKARAのサポート問い合わせでは、フェノール / クロロホルム抽出だけを勧められました。悩むところです。。、 お忙しい中ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9267-4 - 2020/10/30 (金) 01:46:00 - おお >[Re:1] Ｍ１　女さんは書きました : > 宜しくお願いします。Ｍ1の学生です。 > gDNA Removerが入っているならば、その前にDNaseの処理は不必要でしょうか？ > > 今まではＲＮＡ抽出→Recombinant DNase Iのフェノール / クロロホルム抽出→ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Removerで逆転写と、 > ２回もゲノム除去をしていました。 > 工程が多くなるため、Recombinant DNase Iを省略したいと考えています。 その前になぜその工程になっていたのか確認できませんか？qPCR RT Master Mix with gDNA Removerの商品説明をみて普通わざわざそのまえにDNaseI処理はしないと思います。DNaseIはHeat inactivationなどでも失活できますし、そのあたりの工程の変更を考えてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9267-3 - 2020/10/29 (木) 21:28:56 - A 抽出法や材料にもよりますが、ゲノムDNAの残存が起きるので、 このキットは最近は購入していません。 メーカーのサポートに電話した感じでは、別にDNA分解酵素処理を追加するかどうかは、ユーザーの検討、自己責任で、て感じでした。

(無題) 削除/引用 No.9267-2 - 2020/10/29 (木) 21:22:31 - BlueComma コムギではないですが、私もRNeasy Plant Mini KitとReverTra Ace & qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを使っています。抽出したRNAを直接RTしていますが、ゲノムDNAはしっかり分解できます。

ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover　について 削除/引用 No.9267-1 - 2020/10/29 (木) 21:17:13 - Ｍ１　女 宜しくお願いします。Ｍ1の学生です。 コムギの葉を材料にリアルタイムＰＣＲを行うことになりました。 RNeasy Plant Mini Kitを使用します。 その後の逆転写にはReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを使う予定です。 gDNA Removerが入っているならば、その前にDNaseの処理は不必要でしょうか？ 今まではＲＮＡ抽出→Recombinant DNase Iのフェノール / クロロホルム抽出→ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Removerで逆転写と、 ２回もゲノム除去をしていました。 工程が多くなるため、Recombinant DNase Iを省略したいと考えています。 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Removerの使用者の方々、どんな感じでしょうか？宜しくお願いします。

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