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(無題) 削除/引用 No.9266-13 - 2020/11/03 (火) 14:23:53 - キャッサバ太郎 生死を確認する場合であれば、おおさんの仰るようにトリパンでしょうか。 ＞おおさん 論文通りにレサズリンで処理前に測定、処理後MTTという流れかと思っていました。 おおさんの仰るようにレサズリンで前後測定という事でしたら同意見です。 私が想定していたのはくわがたさんの仰っている事と重なります。 まあ論文化されているのである程度精度よく、再現性良くできるという事なのでしょうけれども。 以前申し上げたpromega製品ですが以下の物でした。 https://www.promega.jp/products/cell-health-assays/cell-viability-and-cytotoxicity-assays/realtime_glo-mt-cell-viability-assay/?catNum=G9711

(無題) 削除/引用 No.9266-12 - 2020/11/03 (火) 12:22:51 - くわがた ご存知かとは思いますが，オリジナルのMTTアッセイは反応産物が不溶性のフォルマザン色素ですので，比色定量の際にはDMSO等で可溶化する必要があります．今では反応産物が可用性のものを用いた改良版（WST-8アッセイ等）の方が，可溶化のステップが省けるのでデータの精度も上がりますし，使い勝手が良く，よく用いられている印象です． オルガノイダーさんがお示しになられた論文ではあえてオリジナルのMTTを用いて可溶化しているようですが，これは反応産物が培地中に放出されるレザズリンアッセイとの併用を考えてのことではないかと思います．論文を見ると，レゾルフィンの蛍光測定時の励起波長（つまり吸収がある波長）とMTTアッセイの吸収波長はそれぞれ530 nmと562 nmと比較的近いところで測っていますので，もしレゾルフィンの有意な残留があればMTTアッセイにも影響はあるのでしょうが，どの程度バックグラウンドを上げるかは，MTTを加えないコントロールを置いてみて差し引けば分かる事ですし，おそらく筆者らも都度測定しているものと思います．影響があったとしても測定を阻害する程ではないという事なのではないでしょうか． あと，DNA結合色素を使ってDNA量から細胞数を見積もる場合，細胞周期の影響を受け得るということは一応考慮された方が良いかと思います．

(無題) 削除/引用 No.9266-11 - 2020/11/03 (火) 08:43:16 - おお セルカウントをトレパンブルー染色したあとにする。この方法はちゃんと数としてでる。ただしApoptotic bodyとかばらばらになったものはカウントできないでしょう。 培地のLDH（死細胞から放出される）をはかる方法は昔一時期はやったような気がしますが、血清のロットによってはLDH活性が高くバックグランドが高くなったりします。無血清ばいちとか、Advanced DMEM/Opit-MEMに１％ぐらいの血清を加えるとかしてバックグランドを抑えると測りやすくなるでしょう。培地をとって、残っている細胞をデタージェントで処理してそちらのLDH活性を調べると生細胞の活性も測れるのですが、どうも死んだ細胞からすべてLDHを放出されてないのか、放出されたものが分解されるのか、生細胞と培養上清のLDH比は死細胞が低く見積もられているように感じています。 そのほかPromegaから死細胞から流出したATPやプロテアーゼをはかるキットとか、Cell impermeableなDNA結合蛍光色素などが売られてます。 プロテアーゼを測るやつは確か私の記憶ではそのプロテアーゼの半減期が短いので比較的短い時間のTime windowで測れるといったことが書いてたような気がしますがPromegaの商品の説明を見てください。サンプルをもらったけど一度つかって、使えそうだなと思ったくらいでどんな感じかという感触がつかめる前に使い切ってしまいました。 使用感はまったくないのだけどDNA結合色素はより直接的なんじゃないかなと思わなくもない。 https://www.promega.com/results#q=Cytotoxicity

(無題) 削除/引用 No.9266-10 - 2020/11/02 (月) 23:31:32 - オルガノイダー ＞＞おおさん ＞＞キャッサバ太郎さん 様々なアドバイスありがとうございます！ 最後に初歩的な質問をしてしまうのですが、細胞の生存アッセイは様々な方法がありますが、細胞の生死を確認したい場合、何を選択するのが一番シンプルで、簡単な方法なのでしょうか？（オルガノイドの場合以外で） ご回答よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.9266-9 - 2020/11/01 (日) 05:05:40 - おお >[Re:8] キャッサバ太郎さんは書きました : > レサズリンを使って数日後にMTTという場合、まさにおおさんの仰るようなノイズの影響で面倒なことになる予感がします。 いや私はその件に関しては考えはなかったのですが、、、波長のかぶりとか細かいことは見てないし論文ではやっているので。レサズリンで処理前の細胞数（生細胞の活性）を測り、処理後エンドポイントでもう一度測るという話を前提にコメントを書きました。

(無題) 削除/引用 No.9266-8 - 2020/10/31 (土) 18:12:20 - キャッサバ太郎 とりあえず論文で出ている以上は『できないことはない』という事でしょうし、条件検討してみてはどうでしょうか。 腸管organoidの場合ですが、WSTなどの水溶性ホルマザンを使用した際に内腔への貯留がありました。 レサズリンを使って数日後にMTTという場合、まさにおおさんの仰るようなノイズの影響で面倒なことになる予感がします。 経済的に余裕があるならプロメガで何日か入れておけるタイプのものがあった気がしますがそういうものも検討してみてはいかがでしょうか。 形態がどう変化しているかわかりませんが、それは免染での評価もあわせておこなうほうが個人的には良いと思いますが・・・

(無題) 削除/引用 No.9266-7 - 2020/10/31 (土) 06:41:56 - おお プラクティカルにはなんとも言えませんが最初にくわえたレサズリンとその産物をちゃんと除かないと２回目はバックグランドノイズが強くなりそうです。 それともレサズリンをいれたまま継続して培養して、処理後にもう一回図るということですか？その時は処理前の蛍光や使った薬剤が聞いてくる前までの細胞の活性も２回目の測定に入ってきます。細胞毒性が低く見積もられるでしょうけど、差が見れるほどの違いが見込まれて、測定時の生細胞の量が見積もられてなくてもいいならあり得るやり方かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9266-6 - 2020/10/30 (金) 13:48:30 - オルガノイダー ＞＞キャッサバ太郎さん ご提案ありがとうございます。 培養中のオルガノイドの生細胞数と、薬剤等の添加による細胞の生存率を測定したいです。 添加したい物質はあまり毒性は高くなく、添加中に培養もできているため、添加における形態の変化がポジティブなものなのか、細胞死によるものなのかを確認したいところです。 そのため、単純に添加前後で生細胞数が測定できればと思っています。 そもそもの細胞生存アッセイの知識に乏しいため、いろいろとアドバイスをいただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.9266-5 - 2020/10/30 (金) 13:37:33 - オルガノイダー ＞＞おおさん https://www.nature.com/articles/cddis2014183 Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671120302381 Intestinal Stem Cell Niche Defects Result in Impaired 3D Organoid Formation in Mouse Models of Crohn's Disease-like Ileitis

(無題) 削除/引用 No.9266-4 - 2020/10/30 (金) 00:46:24 - キャッサバ太郎 以前organoidはかじっていたことがあります。 具体的にどういうorganoidを使ってどういう状況のsurvivalを見たいのかにもよるかと思います。 今ほどkitが充実していなかったころだったので補正に難渋しましたが、PromegaのMultiTox-Gloで見れませんか？ オルガノイダーさんのおっしゃるような文献は見たことがありません(不勉強なのはあると思いますが・・・)。 それとMTTもresazulinも結局は同じミトコンドリアの還元を見てるんじゃなかったでしょうか。 同じところを見てnormalizeというのが腑に落ちないのは私だけでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9266-2 - 2020/10/30 (金) 00:19:18 - おお その文献を示せますか？

レサズリンとMTTアッセイ 削除/引用 No.9266-1 - 2020/10/29 (木) 19:46:14 - オルガノイダー こんにちは オルガノイドの研究をしています。 オルガノイドの細胞生存率アッセイをしたいと考えています。 ある論文では、MTTアッセイを行っていますが、その前に、レサズリンアッセイを行い、MTTアッセイの結果を補整する形で細胞生存率を確認しています。 レサズリンアッセイを2回行って細胞生存率を確認することは不可能なのでしょうか？

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