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THP-1の炎症性サイトカイン トピック削除
No.926-TOPIC - 2012/09/14 (金) 02:00:42 - こん
実験を初めて2か月の初心者です。

現在、THP-1細胞をLPSで刺激し炎症性サイトカインのmRNA発現量を測定しています。

THP-1をLPS刺激でIL-6の発現量が増加している論文を見かけますが、IL-6のmRNAが増えなくて困っています。

実験条件は
10%FCS添加のRPMI1640で5×10の5乗THP-1を72時間 100 nM PMAで分化誘導させています。
その細胞を10%FCS添加のRPMI1640に5×10の5乗で蒔きなおし、24時間培養後、1又は10 μg/mL LPS(O111:B4)で1,3,8又は24時間刺激しています。

IL-1、IL-8、TNFaは有意に発現量はふえていますが、論文と比較してあまり発現していなく、だいたい無刺激の2倍くらいとなっています。

ご助言いただけないでしょうか？
よろしくおねがいします。
　
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(無題) 削除/引用
No.926-6 - 2012/09/14 (金) 11:55:39 - こん
皆さんご意見ありがとうございます。

>もちろんそのプライマー使ってポジコンは増えてるんだろうな？じゃなきゃ設計し直せ。
　先輩の実験で同じIL-6のプライマーを用いワークしていたので問題ないかと思っています。また、最近、私も別の細胞をIL-1で刺激すとワークしていました。

>PMAでマクロファージ様に分化するのであれば、分化したTHP１は、ディッシュに固着していて、分化していない浮遊しているTHP1だけを捲き直している可能性はないですか？
　その可能性はあるかもしれません。できるだけ接着しているもの使用しようしています。軽くフラスコをゆすってから上清を捨て残ったものを刺激できたものと考えています。もちろん顕微鏡下で接着しているかも確認しています。

>LPSをµgオーダーで刺激する論文もたまに見かけますが、かなり過剰だと思います。
10ngや100ngで容易に炎症状態を誘導できると思います。
　LPSの濃度は確かに高いと思っています。ちょっとLPS濃度も検討してみます。

>LPSがへたっていませんか？
　3ヶ月前にsigmaから購入し、冷蔵保存していました。使用直前に培養液で溶解し使用しています。一度買い直しもしてみます。

また、先輩からPMA刺激からの時間が問題ではないかとアドバイスを受けました。PMA刺激後24時間培養してから、LPSで刺激していたので、無刺激の発現量が高くなっている可能性があるとご指導してもらいました。

(無題) 削除/引用
No.926-5 - 2012/09/14 (金) 10:22:43 - よっしー
LPSがへたっていませんか？
実験系は違いますが，以前新しいものを買い直すと，1/1000量で同等の反応が出たことがありました．

(無題) 削除/引用
No.926-4 - 2012/09/14 (金) 10:13:03 - PP
THP-1を使用したことがありませんが、IL-6以外の炎症性サイトカインが増加していれば、十分、IL-6も発現すると思います。
私もプライマーが怪しいかと・・・

LPSをµgオーダーで刺激する論文もたまに見かけますが、かなり過剰だと思います。
10ngや100ngで容易に炎症状態を誘導できると思います。

(無題) 削除/引用
No.926-3 - 2012/09/14 (金) 07:37:19 - qq
THP１を使ったことありませんが、

＞100 nM PMAで分化誘導させています。その細胞を10%FCS添加の
＞RPMI1640に5×10の5乗で蒔きなおし、
PMAでマクロファージ様に分化するのであれば、分化したTHP１は、ディッシュに固着していて、分化していない浮遊しているTHP1だけを捲き直している可能性はないですか？

(無題) 削除/引用
No.926-2 - 2012/09/14 (金) 03:29:58 - チンコ
もちろんそのプライマー使ってポジコンは増えてるんだろうな？じゃなきゃ設計し直せ。ちなみにLPSの量多過ぎだぞ。

THP-1の炎症性サイトカイン 削除/引用
No.926-1 - 2012/09/14 (金) 02:00:42 - こん
実験を初めて2か月の初心者です。

現在、THP-1細胞をLPSで刺激し炎症性サイトカインのmRNA発現量を測定しています。

THP-1をLPS刺激でIL-6の発現量が増加している論文を見かけますが、IL-6のmRNAが増えなくて困っています。

実験条件は
10%FCS添加のRPMI1640で5×10の5乗THP-1を72時間 100 nM PMAで分化誘導させています。
その細胞を10%FCS添加のRPMI1640に5×10の5乗で蒔きなおし、24時間培養後、1又は10 μg/mL LPS(O111:B4)で1,3,8又は24時間刺激しています。

IL-1、IL-8、TNFaは有意に発現量はふえていますが、論文と比較してあまり発現していなく、だいたい無刺激の2倍くらいとなっています。

ご助言いただけないでしょうか？
よろしくおねがいします。
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