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(無題) 削除/引用 No.9221-10 - 2020/10/16 (金) 18:20:16 - とり 多くのアドバイスを頂き、重ねて御礼申し上げます。 中心部がPIで染まっており、御指摘の通り中心部が一部壊死して染まっている印象を受けます。本当に死んでいるのか、スフェロイドをほぐしてFACSでまずは検討しようと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9221-9 - 2020/10/16 (金) 07:29:37 - おお https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN33_Live_Dead_staining_with_FDA_and_PI.pdf MCF-7 spheroidの図が載ってました（最後のページ）

(無題) 削除/引用 No.9221-8 - 2020/10/16 (金) 06:31:34 - 素人 スフェロイドには necrotic core と呼ばれる壊死性部位があると聞いたことがあります。 そのような部分の可能性はないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9221-7 - 2020/10/16 (金) 01:43:05 - おお どこが染まってますか？DAPIやHoechstなどでもそまりますか？ 可能性としてはDNA以外の（多分弱い）アフィニティーを持つものに結合してよわい蛍光を拾っているが、Autoの測定でそういうのが見えるように設定されてしまっている。平面培養でCell deathを誘導してその時の設定を記録するなりして、その設定でスフェロイドをみる。ちなみに植物ではPIで細胞壁が染まるようです。 昔の知識ですがスフェロイドは中心部は死細胞があるという話があったので（当時より工夫されていてより機能的になっているかもしれないけど）、健全と思われるスフェロイドでも死細胞が存在する。 スフェロイド形成時に一部細胞が死ぬことにより溶出されたDNAがスフェロイドにまとわりついている。 経験があるわけではないので想像で書いていてなんの助けにもならないかもしれませんが、、、

(無題) 削除/引用 No.9221-6 - 2020/10/16 (金) 00:41:57 - R PIを入れていないwellはありますか？ 画面上にポインタをのせるとRCU（でしたっけ？）で蛍光のIntensityが出ると思いますが、コントロールとトリートメントの細胞を比較して、Intensityの差がないですか？解析のときにコントロール側のRCUをしきい値に設定して計算させると差がでませんか？ ソフト的にはなんとか蛍光を拾おうとして画面上では赤く見せているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9221-5 - 2020/10/15 (木) 18:25:02 - いや やっぱり状況が違うようです。 撤回します。

(無題) 削除/引用 No.9221-4 - 2020/10/15 (木) 18:10:46 - 難しいのでは 違う細胞ですが、FACSでPI陽性と弱陽性と陰性で分けて培養したとき、弱陽性画分にとある性質の細胞集団が濃縮されているという論文出したことあります。 強陽性は死細胞ですが、生細胞で光って見える奴はあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9221-3 - 2020/10/15 (木) 17:09:17 - とり PI 最終濃度 2.5ug/ml でした、失礼しました。

PI染色の生細胞特異性に関して（生細胞がPIで染まってしまう？） 削除/引用 No.9221-1 - 2020/10/15 (木) 17:02:26 - とり お忙しいところ失礼します。 研究を行っている大学院生です。 A549肺がん細胞株でスフェロイド形成実験を行っています。 スフェロイドはU底フラスコで形成しています。 このスフェロイドに薬剤を添加して、細胞死を測定することを試みています。 モニタリング方法として、培養系にPIを最終濃度 0.25 uL/ml で添加し、経時的に 生細胞イメージングシステム　IncuCyte ZOOM System （インキュベーター内に設置された蛍光顕微鏡と考えてください）で 赤色蛍光を見ることをより、計測しようと思っています。 （PIを入れたまま培養するということです） 問題なのですが、A549細胞のスフェロイドの、何も薬剤を添加していないコントロール群に PIを入れて、5分後に、赤色蛍光を観察すると スフェロイド全体が赤色蛍光を示してしまいました。 これはPIでの評価では、「細胞死」を意味します。 しかしながら、スフェロイドをピペット操作でほぐし、ギムザ染色標本を作製すると、核の形も細胞の形も保たれており、細胞死の形態は認められませんでした。 PIが生細胞を非特異的に染めてしまったのか、 細胞がなぜかPIを積極的に取り込んでしまったのか、それともアポトーシス形態をとらない細胞死が誘導されたと考えています。 質問です PIは生細胞を非特異的に染色させてしまうことはありますでしょうか。 なお、平面培養で同様の実験を行いましたが、PIは平面培養のA549細胞を染めることはありませんでした、 抗がん剤を投与して、細胞死を誘導すると、PIで染まってきます。 お忙しいところ申し訳ありませんが、アドバイスいただけましたら幸いです。

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