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(無題) 削除/引用 No.9220-10 - 2020/10/20 (火) 15:43:18 - T-2 アトーのホームページにもあるけどゲルとメンブレンとろ紙を重ねて しっかり押さえるのが重要らしい。 それと転写バッファーを3液タイプに変えたら転写効率が よくなった気がします。

(無題) 削除/引用 No.9220-9 - 2020/10/20 (火) 09:35:29 - MJ >[Re:8] おおさんは書きました : > 転写時のバッファーは何を使ってますか？ ブロッティング装置をアトー社のものを使用しており、メーカー純正のものを使用しております。

(無題) 削除/引用 No.9220-8 - 2020/10/20 (火) 00:10:12 - おお 転写時のバッファーは何を使ってますか？

補足 削除/引用 No.9220-7 - 2020/10/19 (月) 19:17:37 - MJ 多数の方々にご確認頂き、ありがとうございます。 やはり寄せてしまうのは大問題なんだろうと思い、 それをやめてみたところ、真ん中のマーカー付近の転写不良は改善致しました。 皆様、ご指摘いただき、ありがとうございました。 ただ、やはり両端のマーカーはゲルからほぼきれいに転写できているのに、 真ん中のマーカーはゲルに若干残ってしまいます。 これは何でなのでしょうか。 CBBで染色した感じでは、サンプルタンパク質の転写効率に、 変化は見られないように感じるのですが、 マーカーだけに注目してみると、両端のみとても転写効率がいいように 感じてしまいます。 何かご存じであれば、教えて頂けませんでしょうか。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.9220-6 - 2020/10/17 (土) 01:24:08 - おお グラジエントゲルなら物によっては結構低分子側は広がりますよ。ただ指摘があるように広がったままで転写しないと変になる可能性があります。 ゲルの端のマーカーが写りにくいのは電流の流れの違いかもしれませんゲルの厚みのためゲルの周りのバッファーが枯れているとかなんかそんなことが起こっているかもとちょっと想像しています。

(無題) 削除/引用 No.9220-5 - 2020/10/16 (金) 18:31:18 - C これは原因は転写でなくてゲルだと思います。通常、下がそんなにまで広がることはないです。泳動終了後のゲルはほぼ綺麗な長方形です。泳動後に下が広がるのは、既成ゲルで期限切れのすごい古いやつとかでは経験あります。ゲルの素性やアクリルアミドなど試薬を確認ください。多分ゲル濃度が不均一なのだと思う。既成ゲルも売ってるし、一度試されたら。

(無題) 削除/引用 No.9220-4 - 2020/10/15 (木) 15:30:02 - qq ＞転写をするときに、低分子側が広がっているため、 ＞メンブレンに乗り切らず、はみ出した部分を寄せて、 ＞メンブレンの中に入れておりました。 これが何をしているのか判らねど、大変すごい（ひどい）ことをやっているような感じです。 ゲルと膜の間は当然、密着している必要があります。寄せちゃだめじゃないかなぁ。 あと、個人的な印象だけど、転写するためにはグラジエントゲルでないほうがいいと思うね。

(無題) 削除/引用 No.9220-3 - 2020/10/14 (水) 20:39:42 - MJ ありがとうございます。 1. semi-dry 2. 金属です。多分ステンレス？ 4. 最近ゲルの大きさを変えたのでその時くらいからです。 5. 変更はしておりません。ただ、グラジエントゲルを使用していて、 転写をするときに、低分子側が広がっているため、 メンブレンに乗り切らず、はみ出した部分を寄せて、 メンブレンの中に入れておりました。 ご指摘の通り、マーカーのことはあまり信用していないので、 私もCBBで染色したりして、タンパク質の転写効率を確認しました。 また、ブロッティング装置もメーカーに点検してもらいましたが、 ほぼ問題はない状態でした。 さらに、メーカーの方でもサンプルを流してもらい、 CBB染色で確認してもらったのですが、真ん中にマーカーを入れないと、 そこまでレーンごとに差があるように見えないのに、 真ん中にマーカーを入れると、真ん中のマーカーだけマーカーの色素が、 残っているのです。 点検に出す前の実験の結果で、真ん中のところの目的バンドが薄かったので、 実験の結果なのか、転写効率が悪いのか、その原因が気になってしまい、 投稿させて頂きました。

(無題) 削除/引用 No.9220-2 - 2020/10/14 (水) 20:05:33 - C とりあえず基本情報please 1. Wet or semi-dry? 2. Semi-dryなら電極板の材質はなんでしょうか。石みたいなの（炭素）か金属っぽいやつか。？ 3. Wet ならスポンジ（ファイバーパットとかいうやつ）は潰れてないか？ 4. 前からそうなのか、ここ最近変になったか。 5. なんか最近変わったことしたか。 経験的にはマーカーはどこのメーカーのものもどちらかというとかなり転写されやすく200Kとか高分子量のもの以外はほぼ残らないような印象ですので（マーカーがいい感じで転写されていてもそれで転写OKとか安心しちゃダメだよとか習ったし）、それが残ってるのは（Semo-dryなら）電極板とか（Wetなら）カセットホルダーとかの劣化や破損などやっぱ機器の構造的な原因のような気がしますので、メーカーに点検に出されるのが一番良いと思います。

タンパク質のPVDF膜への転写のムラ 削除/引用 No.9220-1 - 2020/10/14 (水) 18:33:26 - MJ いつも拝見しております。 タンパク質の解析でウェスタンブロットを行っているのですが、 マーカーを両端と真ん中に入れると、 両端のマーカーは膜にほとんど抜けているのに、 真ん中のマーカーだけが残ってしまいます。 そのため、転写にムラが出てしまっているのかと思い、 CBB染色を行ってみたのですが、 マーカー以外のウェルに流したタンパク質は、 真ん中のマーカー程ムラがあるわけではなく、 むしろ気づかないくらいだったのです。 実験には支障がないかと思いますが、 なぜそういったことが起きるのか気になっております。 もしご存じの方がおられたら教えて頂けませんでしょうか。 よろしくお願い致します。

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