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(無題) 削除/引用 No.9218-10 - 2020/10/15 (木) 18:30:08 - そういえば 実験医学別冊 あなたのタンパク質精製、大丈夫ですか？ ISBN 978-4-7581-2238-2 に、複数のプライマーで長鎖DNAを合成する方法が記載されています。 人工遺伝子が安くなってきたのであまり意味がないかもしれませんが、ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.9218-9 - 2020/10/15 (木) 14:52:12 - G25 一回目のPCRでうっすら見えていたのに、それを二巡目をnestedでかけても増えないというなら、うっすら見えていたのは偽物でしょう。本当なら、一回目で見えていなくても二巡目で見えるというくらいのもんです。 要はnested PCRと同じようなことをnested primerじゃなく、最初のPCRと同じプライマーでやるってことでしょう。そういう方法がないわけでもないです。でも、nested primerの代替としてやるとか、非常に多くのPCR産物が必要で拡大再生産をするとか、そういうときでしょうかね。すでにより効果的で信頼性のあるnested PCRをやっているのだから、その劣化版をやることにはあまり期待はできません。もちろん試すのは自由。 同じプライマーでも二段階でPCRすることにはそれなりの意味もあって、 サイクルを増やすことに伴う酵素の失活、基質、プライマー、鋳型濃度のバランスの変化による悪影響を回避することが期待できるし、 鋳型となる標的DNA配列対その他のDNA配列の比率を一回目のPCRで多少なりとも上げておいてから、二回目のPCRをスタートするというのも反応に有利そうです。 dNTP濃度など基質もバランスが崩れてくるとエラーが起こりやすくなりますが、反応条件が良いときでも確率的にエラーは入るので、結局40サイクルまわすなら、二回にわけてやってもエラーの低減効果は期待しないほうがいいかなあ。

(無題) 削除/引用 No.9218-8 - 2020/10/14 (水) 15:46:26 - asan 意味がないことはないけど、クローニング目的ならば適当にラボにある細胞株やマウスならtissueサンプルのcDNAを手に入れてパネルでPCRをかけて見てかかる細胞細胞を探してクローニングした方がぶっちゃけ手っ取り早いですよ。 ORFのクローニングの場合はprimerの設計できる部分に限界があるので考えても限界があります。全長がでかいならシーケンスを読むのも手間なのでaddgeneとかで買ってしまうほうがかえって安上がりだったりすることもあります。

(無題) 削除/引用 No.9218-7 - 2020/10/14 (水) 14:42:23 - おお 発現の確認のための短めのPCR産物ができるようなプライマーを念の為設計しておいたほうがいいかもしれないね。

(無題) 削除/引用 No.9218-6 - 2020/10/14 (水) 11:29:03 - 参考 http://xena.ucsc.edu/welcome-to-ucsc-xena Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) →Gene Expression →Phenotypic →Site Primary で、ヒートマップを出して、エクセルファイルをダウンロードしてください。 細胞株で発現量が高い順に並びます

(無題) 削除/引用 No.9218-5 - 2020/10/14 (水) 11:05:23 - ど素人 詳しくないので分かりませんが、 nest で PCR をかけて増幅しない場合、増幅していると思っている DNA が目的のものと違う可能性がありませんでしょうか。 32サイクルでやっとみえるバンドが目的のもので間違いないなら、単純にサイクル数を増やすのではいかがでしょうか。PCRを2回に分けて正確性が上がるという理論は、酵素などを変えるのでなければよく分からない気がしますが... 一般にクローニングするのに、かすかに見えれば十分だと思いますが...

(無題) 削除/引用 No.9218-4 - 2020/10/14 (水) 09:48:15 - おお Total RNAからmRNAだけを精製する（これを応用すると目的のRNAだけを精製することも可能ではあるけど）。 RTでスペシフィックプライマーを使う（Oligo dTとかランダムヘキサマーではなくて） 長いとか、かかりにくい箇所があるなら前半部分と後半部分を分けて増幅し、後でつなげる（つなげる方法論もたきにわたるのでいろいろ考えてみてください）。 RNaseHをくわえてPCRの前にRNAを消化する。 PCR酵素を変える。 アニーリング温度をふったりタッチダウンなどを試してみる。 ベタインなど添加物を試す（わたしはあまりGCにこだわらずとりあえず入れてます、うまく行かないことに気がついてからいれると二度手間なので）。 材料をかえる。 ゲノムを増幅できないか調べてみる。 かなりのORFなどがベクターに組み込まれた商品になっているので探してみる、特にモデル生物（Origeneとか）。 合成委託する。 論文などで同じ遺伝子を使っていたなら分与可能か聞いてみる。 諦める と書いてみましたが、やっと見えるほど増えているというなら、プラスミドに入れるには十分だと思う（目的のものがふえているのなら）。どうしてもと言うなら、そのやっと見えるという条件でPCRチューブを１０本使うと単純に１０倍の量がとれる。

(無題) 削除/引用 No.9218-3 - 2020/10/14 (水) 09:29:42 - PCR 参考様 早速コメントをお寄せくださり、ありがとうございます。 おっしゃる通り発現比率だけの可能性はありません。すみません。 長さは1 kbほどです。 他の遺伝子のクローニングも同時並行で行なっていたため、PCR試薬やリアクションは問題なさそうです。 プライマー配列はダブルチェックを行なっています。 サイトをお知らせくださり、ありがとうございます。 まずこのサイトで何ができるのかを調べてみます。 もし同一のプライマーでの2度のPCRによりエラーなく増幅できるのかを試された方がいらっしゃいましたら、どうか書き込みをいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9218-2 - 2020/10/14 (水) 08:42:13 - 参考 本当に発現比率で考えてしまって大丈夫でしょうか。 参考までに、長さなどの情報は開示できますか？ 短いものでしたら、gBlockなどで作ってしまうのも手段の一つですし、 もしかしたらGC含量が高いためにPCR増幅が行われていない可能性などもあるかもしれません。 （その場合、私はベタインを最終濃度 1Mで試しています） また、発現量が高い細胞株を下記サイトで特定し、細胞株のcDNAからクローニングするのも手段です。 http://xena.ucsc.edu/welcome-to-ucsc-xena

PCRでの遺伝子クローニングについて。 削除/引用 No.9218-1 - 2020/10/14 (水) 06:36:57 - PCR 質問させてください。 私はある遺伝子をクローニングしたいのですが、その遺伝子を特異的に発現する細胞の存在比率が臓器で低いためか、32サイクルでもやっと見えるくらいで、結果も安定しません。 nested PCRを試しては見ましたが、その場合には何もバンドが見えませんでした。 そこでえ全く同じプライマーを利用し、最初に10サイクルほど回し、そのPCR反応液を2度目のPCRに使用して30サイクル程度まで回したらがっつりバンドが見えるのではないか、また、PCRエラーも少ないのではないかと素人判断で考えつきました。 このようなこと（全く同じプライマーでPCR（10+30サイクル））に意味はあるでしょうか？ それとも出来上がる物に含まれるエラーは、単純に一度に40サイクルPCRしたと理論上同じということになりますでしょうか？ どうにかクローニングをクリアしたいです。 お力をお貸しいたけけますと幸いです。

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