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(無題) 削除/引用 No.9216-25 - 2020/10/15 (木) 23:11:29 - phos >>ななし様 再現性を高めるといったところでもやはり液体窒素の方が良さそうですね。 サンプル自体は多くはないものの、oniceは少し不安が残ります、、。 ご丁な回答とても、助かります。 本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9216-24 - 2020/10/15 (木) 09:37:34 - ななし >[Re:20] phosさんは書きました : > >>ななし様 > 今のプロトコルではonIceにてLysateを調整しています。 温度に敏感なリン酸化部位はiceに置いた瞬間からどんどん変化します。 すぐにlysisできればいいですが、処理するwell数が多いと最初と最後でかなりばらつきが出ます。 とにかく最短時間で、プレートごと液体窒素で凍結するとその時点でのリン酸化修飾が保持されるので、その後にlysis bufferを各wellに加えてゆっくりとlysateを回収しています。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.9216-23 - 2020/10/15 (木) 01:28:15 - phos >>asan様 ご指摘ごもっともでございます。 一度、以前作られた別のサンプルをポジコンとして置いてみましたが、こちらでは検出されました。 もともとあまりいい抗体ではないこともあって、サンプル調整も見直そうと考えた次第です。 ご回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9216-22 - 2020/10/15 (木) 01:25:24 - phos >>TS様 わざわざ参考まで引用していただきありがとうございます。 とりあえずPPiカクテルを購入してみましたが、今後も使うようでしたらそちらのrecipeを参考にさせていただきたいと思います。 やはり既製品をconstantに購入するにはお金がかかりますね。。 ご回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9216-21 - 2020/10/15 (木) 01:21:49 - phos >>vcvひ様 ご丁寧なprotcolを記載いただきまして、慣れないことも多いためとても助かります。 まずは直接SDSにて調整する方法で試してみたいと思います。 あとはリン酸化が検出されることを祈るばかりです。 ご回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9216-20 - 2020/10/15 (木) 01:17:16 - phos >>ななし様 今のプロトコルではonIceにてLysateを調整しています。一応boilまでは温度には気を付けているつもりではありますが、液体窒素という手もあるのですね。 液体窒素での調整はしたことがありませんでしたが、視野に入れて今後実験したいと思います。 ご回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9216-19 - 2020/10/15 (木) 01:12:40 - phos >>おお様 丁寧なご回答ありがとうございます。 私自身、勉強がいささか足りないことを実感いたしました。 教授いただいた内容について改めて整理してみます。 また分からないことがあれば質問させていただければと思います。 ご回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9216-18 - 2020/10/14 (水) 15:49:29 - asan バンドが見えないならまず疑うことは、ポジコンネガコンを用意して、抗体が死んでない・わーくしないことやそもそもの自分の手技的に何か問題がないことをちゃんと確認した上でサンプルの条件を検証していくべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.9216-17 - 2020/10/14 (水) 11:57:45 - TS 有名どころの製品を調べてみればレシピが書いてあるところもあって参考になりますよ。 例えば違うサイトですが。 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/524625?lang=ja&region=JP&cm_sp=Insite-_-caContent_prodMerch_gruCrossEntropy-_-prodMerch10-4 うちのは濃いめですね。100Xのカクテルで。 Imidazole500 mM Sodium Fluoride1000 mM Sodium molybdate dihydrate250 mM Sodium tartrate dihydrate500 mM グリセロール２リン酸は、濃いのが作りにくいので、毎回powderを10mMでLysis bufferに入れていて、Orthovanadateは熱処理して活性化するので、200mM（x100）を別に作っています。 Use of vanadate as protein phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Gordon J (1991) Methods Enzymol 201:477-82.

追記 削除/引用 No.9216-16 - 2020/10/14 (水) 11:41:20 - vcvひ 追記 2の方法で、TCAが残存していると最後にBPB入れた時まだ酸性で黄色くなることがあります。その際はごく少量の1.5MTris HCL ph8.8を加えて青くしてから電気泳動してください。黄色のまま泳動すると泳動パタンが乱れます。

(無題) 削除/引用 No.9216-15 - 2020/10/14 (水) 11:36:41 - vcvひ 1. 始めからSDSを使う方法 PBSでディッシュの細胞を２回くらい洗う（トリプシンとかで剥がさないこと）→SDS-sample bufer（betaMEなし、BPBなし+phosphatase inhibitor（適当量）で直接溶解→シリンジor超音波処理（軽くサクッと）でDNAせん断→遠心して不溶物除去（多分ほとんど何もないはず）→上清回収→一部タンパク質定量用にとる→bME,BPB入れる（液量多すぎるとタンパク質濃度が低くなりすぎるので注意。なるべく少なめで試す）→加熱処理→電気泳動 2. 10%TCA（トリクロロ酢酸）を使う方法（注：この方法はリン酸化ヒスチジンの検出には使えません） 例：6cm-dishの場合　 PBSでディッシュの細胞を２回くらい洗う（トリプシンとかで剥がさないこと）→10%TCAを1ml 入れる→セルスクレイパーで細胞掻き取る→2mlチューブに移す→ディッシュを新たに10%TCAで洗い、残りの細胞を回収し先のチューブの液と合わせる（2mlのTCA細胞懸濁液）→氷中に１時間 or more 置く。→遠心（12000xg, 20mn 4C) →上清できるだけ完全に除去→沈殿を冷アセトン1~2mlに懸濁→遠心（12000xg, 10min 4C)→上清除去→このアセトンによる洗浄操作はもう一度行う→アセトンを除去し、室温で10分くらい放置してアセトンを蒸発させる→少量のSDS-sammple buffer（betaMEなし、BPBなし)に懸濁し沈殿を溶かす（しばしば溶けにくいので時間かかるかもしれない、液量多いとタンパク質濃度が低くなりすぎて困るので注意）→遠心して不溶物除去→上清回収→一部タンパク質定量用にとる→bME,BPB入れる→加熱処理→電気泳動 *液量はやりやすいように適宜改変してください。 *TCAは強い酸で、皮膚を傷害しますので注意してください、机などにこぼしたりしたら十分な水を使いよく拭き取りましょう）

(無題) 削除/引用 No.9216-14 - 2020/10/14 (水) 09:41:52 - ななし 細胞からのライセート回収の手順はどうなっていますか？ リン酸化状態が変化しやすいタンパクを見るときは、培地だけ捨ててすぐにプレートを液体窒素で凍らせて、その後lysateを回収したほうが良いです。 特にAMPKのようなリン酸化がコロコロ変わるようなタンパクを見るときにオススメです。

(無題) 削除/引用 No.9216-13 - 2020/10/13 (火) 23:45:12 - おお >[Re:11] phosさんは書きました : > >>おお様 > EDTA水溶液を作る際は2Naを使いますが、4Naを使う際はpH調整し力価を合わせて使っています。 意味がわかりません。pHとかで力価ってなんの力価か、、、そもそもTrisバッファーを含む溶液に加えるとそのpHに支配されることになる。EDTA２NaのpHを合わすのはストック用５００mMとか溶けにくいからでEDTA4NaであればpHを気を使わなくても溶けるはず。 > > > Mg＋＋濃度はゲノムDNAを溶出しないようにするなら５mM程度あったほうがいいけど、それ以外なら１mM入っていればいい。KinaseやPhosphataseはMg＋＋依存的なものもまあまああると思うので一層のこと入れないでいいんじゃないかな。 > > なるほど。勉強になります。MgはZn、Mnにくらべて酵素活性化力が弱いため競合的に阻害する目的で過剰に加えているものだと理解していましたが、 Zn、Mnの要求性がない酵素には関係ないでしょう。どこからそんな理屈が来たのか教えてほしいです。哺乳動物の細胞内の生理的なMg++の濃度は１mMほどでそれに合わせているのがたいていだと思います。でもあなたの実験は生理的な状態を保って蛋白を溶出するのではありませんから（酵素活性を図ったりせずに抽出してすぐに変性しWBするわけだから）、生理的にどうこう考える必要もですよね。 >もしMgを添加しない場合はEDTAの濃度はどうされていますか？ EDTAは１から２mM入っていればいいでしょう。金属イオンとしてはMgが最も多いのだと思いますし、それ以上の濃度があれば細胞内の金属イオンはほぼトラップされるでしょうから（蛋白内で強く結合している場合をのぞいては）。EGTA １mMと併用する人もいますね。 > > また、Lysisするときに脱リン酸化が進むのがコントロールしにくいなら、いきなりサンプルバッファーとか、Hot lysis Buffer （１％ SDSが含まれる）で変性と抽出を一気にやってしまうてもある。TCAや有機溶媒で細胞を処理して凝縮した蛋白を回収、抽出して使うというのもありかもしれない。抽出がちょっと厄介な場合もあるけど。 > > そういった方法もあるのですね。次のサンプル調整にて試してみたいと思います。 > 一つ質問があるのですが、Hotとはbufferの温度と理解しますがどの程度の温度で用いてますか？ Hot Lysis buffer で検索してみてください。細胞をLysis後すぐにボイルして酵素活性は蛋白相互作用を破壊してしまうように考えられたLysis bufferです。

(無題) 削除/引用 No.9216-12 - 2020/10/13 (火) 20:17:17 - phos >>TS様 参考にさせていたきたいので、宜しければ使用する際の濃度など教えていただければ幸いです。 頼りきりで申し訳ないのですが、、、どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.9216-11 - 2020/10/13 (火) 20:14:42 - phos >>おお様 > EDTAもEDTA Naも一緒だわ。。。 大抵はEDTA ２Na塩を使うと思うけど。Lysis buffer中に１ mM程度しか入れないだろうからナトリウムの濃度が２mMくらい変わる程度でどれ使っても一緒と思っていいと思う。 EDTA水溶液を作る際は2Naを使いますが、4Naを使う際はpH調整し力価を合わせて使っています。 > Mg＋＋濃度はゲノムDNAを溶出しないようにするなら５mM程度あったほうがいいけど、それ以外なら１mM入っていればいい。KinaseやPhosphataseはMg＋＋依存的なものもまあまああると思うので一層のこと入れないでいいんじゃないかな。 なるほど。勉強になります。MgはZn、Mnにくらべて酵素活性化力が弱いため競合的に阻害する目的で過剰に加えているものだと理解していましたが、もしMgを添加しない場合はEDTAの濃度はどうされていますか？ > また、Lysisするときに脱リン酸化が進むのがコントロールしにくいなら、いきなりサンプルバッファーとか、Hot lysis Buffer （１％ SDSが含まれる）で変性と抽出を一気にやってしまうてもある。TCAや有機溶媒で細胞を処理して凝縮した蛋白を回収、抽出して使うというのもありかもしれない。抽出がちょっと厄介な場合もあるけど。 そういった方法もあるのですね。次のサンプル調整にて試してみたいと思います。 一つ質問があるのですが、Hotとはbufferの温度と理解しますがどの程度の温度で用いてますか？ 無知ゆえの質問ばかりで申し訳ありません。 大変参考になるご教授ばかりでした。ご回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9216-10 - 2020/10/13 (火) 16:41:37 - おお どうでもいいけどsodium pyrophosphateは使おうとは思わなかったのかな。。。

(無題) 削除/引用 No.9216-9 - 2020/10/13 (火) 16:17:46 - おお >[Re:7] phosさんは書きました : > とても有益な情報ありがとうございます。ラボのインデックスを調べましたがEDTA・Naしかありませんのでカクテルの購入も考えてみます。 EDTAもEDTA Naも一緒だわ。。。 大抵はEDTA ２Na塩を使うと思うけど。Lysis buffer中に１ mM程度しか入れないだろうからナトリウムの濃度が２mMくらい変わる程度でどれ使っても一緒と思っていいと思う。 Mg＋＋濃度はゲノムDNAを溶出しないようにするなら５mM程度あったほうがいいけど、それ以外なら１mM入っていればいい。KinaseやPhosphataseはMg＋＋依存的なものもまあまああると思うので一層のこと入れないでいいんじゃないかな。 雑多な蛋白を溶出しすぎて総蛋白量あたりの目的の蛋白量が少なくなることを考えるなら、sodium Deoxycholate 0.5% SDS 0.1%は使わなくていい（目的の蛋白が十分溶出できているなら）。 また、Lysisするときに脱リン酸化が進むのがコントロールしにくいなら、いきなりサンプルバッファーとか、Hot lysis Buffer （１％ SDSが含まれる）で変性と抽出を一気にやってしまうてもある。TCAや有機溶媒で細胞を処理して凝縮した蛋白を回収、抽出して使うというのもありかもしれない。抽出がちょっと厄介な場合もあるけど。 またIPをかますと検出しやすくなる可能性がある。

(無題) 削除/引用 No.9216-8 - 2020/10/13 (火) 14:26:38 - TS わたしは結構使うので節約のために単品で購入して混ぜて作っています。 少量ならカクテルを購入しちゃったほうが安くなる気がします。

(無題) 削除/引用 No.9216-7 - 2020/10/13 (火) 14:04:00 - phos >> TS様 とても有益な情報ありがとうございます。ラボのインデックスを調べましたがEDTA・Naしかありませんのでカクテルの購入も考えてみます。 記載を忘れてしまいましたが、PIsとDTTも最終的に添加します。 ご回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9216-6 - 2020/10/13 (火) 13:57:31 - phos >>qq様 すみません。NaF,β-Glyに関しては記載ミスです。それぞれ0.5Mの溶液を2%で調整しています・・。 MgClについては濃いのですね。通常はbufferにEDTAを添加する際には何倍量程度のMgClが適正なんでしょうか？ ご回答ありがとうございます。

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