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(無題) 削除/引用 No.921-10 - 2012/09/14 (金) 19:10:59 - US_KN おおさん、qqさん 貴重なアドバイスありがとうございます。 みなさんのアドバイスのお陰で、たくさんのことを学ぶことができました。 本研究室では内部標準と目的Proteinの相対バンド強度を比較する評価の仕方を以前から行っておりまして、 その影響で、今も同じような方法で実験を行っております。 内部標準の転写率もほぼ一定と、大きく外れたことはないので 今まで改善せずにこのやり方でやってきたんだと思います。 みなさんのアドバイスを参考に、今後の実験を改善できるよう努めたいと思います。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.921-9 - 2012/09/13 (木) 16:35:01 - おお >内部標準を入れてブロットする必然性がどこかにあるのでしょうね。 わたしもそうおもいましたけど、わざわざ加えないでも通常はトランスファーした膜をponceauとかで染めるとかすれば転写の工合はわかりますよね。それか何かハウスキーピングジーンみたいなものでWBするか。何か特殊な実験を組んでいるのかもしれませんけど。 いっそのこと膜上で活性がはかれないかなぁとか空想しちゃいます。

(無題) 削除/引用 No.921-8 - 2012/09/13 (木) 16:28:03 - おお >今回膜に転写した物質がStrippingによりはがれてしまったと仮定した場合、 >サンプル調整に用いたバッファーの問題、 >あるいは電気泳動や転写に問題があるのでしょうか。 ちょっとこたえがとうまわしになっちゃいましたが、トランスファーでついたものがつけた条件でstrippingの感受性が違うというのはないようなきがします。ただメタノール抜きでとらんすふぁーするとか(ふだんは入れているのに)極端な事をしているとご指摘の可能性を否定しにくい要素がふえるとは思っています。

(無題) 削除/引用 No.921-7 - 2012/09/13 (木) 16:23:41 - qq 横から入ってきて失礼しますよ。 ＞内部標準として加えたβ-galactosidase は、E.coliのβ-galactosidaseですか？ そうだとすると、分子量120kDa程度だと思いますが、定量的に転写されていますか？ 内部標準でつかうタンパクの転写効率が一定でないと、内部標準をいれる意味は、無くなってしまいますよね。というか、内部標準を加えてウェスタンをしたことがない。あんまり見ないけれど、内部標準を入れてブロットする必然性がどこかにあるのでしょうね。 そもそも、PVDF膜を上下2つに切断して、内部標準とあなたが検出したいラット脳のタンパク質を別々に抗体検出するのではダメなのですか？？

(無題) 削除/引用 No.921-6 - 2012/09/13 (木) 16:22:01 - おお >[Re:5] US_KNさんは書きました : > > 今回膜に転写した物質がStrippingによりはがれてしまったと仮定した場合、 > サンプル調整に用いたバッファーの問題、 > あるいは電気泳動や転写に問題があるのでしょうか。 > 一般論としてstrippingの度にシグナルは弱くなると思いますが、同じことを以前にして検出できていたのであれば、stripping以外のところに問題があるという推察はできると思います。ただし、WBもほんとにほぼ同じ感度で毎回できるかと言うとそれもちょっと疑わしい(いろいろな要因でぶれがあってもおかしくない)ので、その範囲でコントロールできる範囲なのか、そうでないのか見極めないととおもいますが、同時にそれも極端な場合でないと難しいかもしれません。少なくともSDSPAGEとトランスファーは毎回チェックしておくのが望ましいと思います。 いろいろな制約があると思いますが、2枚同じブロットを用意した方がトラブルが起こりにくいとはいえると思います。 >2回目の物質は内部標準として加えたβ-galactosidaseになります。 念のためですがこの検出系じたいはほかの実験などでワークしているのを確認済みですよね?

(無題) 削除/引用 No.921-5 - 2012/09/13 (木) 15:51:47 - US_KN おおさん、迅速なご回答ありがとうございます。 私の説明不足で、正確に情報をお伝えできなかった点、 申し訳ございません。 1回目の目的Proteinと 2回目の目的物質は異なるものになります。 1回目の目的Proteinはラット脳中に存在するProteinになりまして 2回目の物質は内部標準として加えたβ-galactosidaseになります。 サンプル調製の際に加えたβ-galactosidaseは Strippingを考え、濃度の高いものを用いています。 今回膜に転写した物質がStrippingによりはがれてしまったと仮定した場合、 サンプル調整に用いたバッファーの問題、 あるいは電気泳動や転写に問題があるのでしょうか。 度々の質問に大変恐縮ですが、 ご回答のほど、宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.921-4 - 2012/09/13 (木) 15:26:42 - おお >[Re:3] US_KNさんは書きました : > > Strippingで転写した物質がはがれてしまったり、 > 逆に1回目の抗体が落ち切ってないことはありますでしょうか。 ウエスタンでのせたproteinがはがれているかどうかはスペキュレーションですが(おそらくはがれるのだろうとおもいますけど)、strippingのたびにシグナルが弱くなるという感覚はあります。ニトロセルロースを日ごろよく使っていますがPVDFをよく使う人もやはり弱くなってくるとはいっています。 Strippingで抗体が残っていることは特に強いシグナルの抗体ではよくあることだと思いますが、これはstrippingの強さにも依存します。SDSをいれて温めているのであればまあ可也強力ではあるとおもいますが、はがれるとすればはがれる量も多いかとも思います。ぎゃくに同じものを検出するのであれば(違う抗体で同じものであるが修飾や何らかの違いを見るとかでない場合は)抗体が残っていてもあまり気にならないはずですが、というかstrippingすら必要ないと思いますが、、、バックグランドやノンスペのためstringencyを上げたいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.921-3 - 2012/09/13 (木) 15:04:01 - US_KN おおさん貴重なアドバイスありがとうございます。 Strippingが問題と考えた理由と致ししては、 同じ物質を一回目の抗体反応で検出するとバンドが出るのですが、 Strippingを行い、再度同じ物質を検出を試みましたが 検出されなかったので、Strippingの問題なのではないかと考えました。 2回目の抗体も同種由来であるため、Strippingを行っています。 また抗体をTOYOBO社のCan get signal solutionで希釈して反応させています。 Can get signal solutionは反応性が強いため しっかりStrippingをした方が良いと考えたのですが...。 Strippingで転写した物質がはがれてしまったり、 逆に1回目の抗体が落ち切ってないことはありますでしょうか。 ご回答頂けると幸いです。 宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.921-2 - 2012/09/12 (水) 23:37:02 - おお Strippingの問題か、WBの感度が落ちてきただけの話なのか、Strippingが問題である根拠がありますか?わたしはもっとマイルドな方法でやることが多いです。最初の検出でシグナルが非常に弱いものを選ぶと、Strippingなしで、2回目の一次抗体であざいどを加えるだけ十分だったりします。2回目が異種由来の抗体であれば同じ手が使えます。マイルドなものとして、SDSをTRITON-X100 1%ぐらいに変えるとか、0.1-0.2N水酸化ナトリウムを加えるとかグリシン、pH2ぐらいを使うとか、、、バリエーションはいっぱいあります。

PVDF膜のリプロービングについて教えて頂けますでしょうか。 削除/引用 No.921-1 - 2012/09/12 (水) 19:12:08 - US_KN PVDF膜をメルカプトMeOHを含んだTris-SDS溶液で50℃にて30分Strippingし、 10分、2回洗浄液で洗浄した後 30分Blockingしてリプロービングを行っています。 リプロービングであるため、抗体も少し濃いめにして反応させ、 反応時間も長めにしています。 以前まで問題なくリプロービングした膜の目的物質の検出ができたのですが、 最近検出されなくなりました。 特に試薬などを変えたりしてないのすが...。 目的物質は内部標準のβ-galactosidaseになります。 勉強不足で大変恐縮ですが アドバイス頂けますでしょうか。 宜しくお願い致します。

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