初めて質問させて頂きます。ご教授してくだされば幸いです。
私は現在、未知の膜タンパク質の受容体の探索及び同定のため、受容体と結合する大腸菌発現系のHisタグ精製タンパク質を用いて、Pull-down及びFar-westernを行っています。
Pull-downにおいて受容体だと思われるタンパク質があることを確認しました。
このPull-downのゲルを転写し、メンブレン上のタンパク質を塩酸グアニジンで再生・変性後、精製タンパク質を加えてインキュベートし、精製タンパク質に対する抗体で、Pull-downで確認された受容体のバンドと同じ分子量にバンドが見えるよう試みています。
(Pulldownのサンプルに関してですが、細胞のライセート,Hisタグ精製タンパク質,Ni-magneticビーズをエッペンで混和し、磁石でNiビーズを引き寄せ上清除去後,Sample buffer solutionを加え95℃, 5min ヒートブロック後に磁石で上清を回収したサンプルです。)
しかし、Pulldownで確認した受容体であろうバンドを全く確認することができませんでした。
その原因として、@washの際にTween-TBSを用いているため、メンブレン上の受容体と結合した精製タンパク質がwashの際に剥がれてしまった、あるいはAタンパク質の変性・再生のステップが上手くできていないことだと考えています。
論文のプロトコルを参考に自分でプロトコルを作製したのですが、私が作製したプロトコルに自信がなく、
もしもFar-western を行ったことがある方がいらっしゃいましたらアドバイスや改善点をご教授してくだされば幸いです。
【方法(メンブレンに転写後から)】
@ 6M guanidine-HCl 変性バッファー(8Mguanidine-HCl 9.375mL, 1M tris-HCl(pH7.5) 0.25mL, 10% Tween 20, 62.5µL, 1M DTT 12.5µL, DDWを加えて12.5mLにメスアップ)及び、0M guanidine-HCl 再生バッファー(1M Tris-HCl(pH7.5) 1mL, 10% Tween-20 250µL, 1M DTT 50µL, DDWを加えて50mLにメスアップ)を作製し、6M,3M,1.5M,0.75M,0.38M,0M(各6.25 mL)まで段階希釈した溶液を作製して4℃に保存
A プラスチック箱に6M guanidine-HCl(6.25mL)を加えメンブレンを浸し 4℃,10min,シェイカーで震盪
BAを新しいプラ箱に3M溶液を加えメンブレンを移して同条件で震盪し、これを0Mまで繰り返す。
C新しいプラ箱にOdyssey（ブロッキングバッファー）を5mL加え、メンブレンを加えて 4℃, 30min, シェイカーで震盪
Dこのプラ箱の溶液に精製タンパク質を5µg加え4℃, オーバーナイト, シェイカーで震盪
E翌朝,Tween-TBS(TBST)でwash 4℃, 10min, シェイカーで震盪。これを３回繰り返す。
F溶液除去後、5mLのブロッキングバッファーに1次抗体を入れた溶液を箱に入れ室温, 2hr, シェイカーで震盪
G溶液除去後、TBST 5mL で軽く2回洗浄後, ブロッキングバッファーに2次抗体を入れた溶液を箱に入れ室温, 1hr, シェイカーで震盪
HTBST 5mL で2回wash後、TBST 5mL でwash 室温, 1hr, シャイカーで震盪
ITBSTで2回wash後,蛍光を検出
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