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ウエスタンブロッティングの還元剤の有無 トピック削除
No.9177-TOPIC - 2020/09/25 (金) 12:59:58 - いる７
お世話になっております。ヒト腫瘍細胞株を用いたウエスタンブロッティングを行う予定です。サンプル調整に還元剤非含有の物を用い多量体のまま測定する事があるとネットで調べたのですが、どのような場合なのでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.9177-5 - 2020/09/25 (金) 21:30:54 - おお
実験条件が多岐にわたるために一言では言えません。
変性条件で大抵の蛋白は蛋白相互作用を失いますが、その状態でも非還元で相互作用を維持しているならS-S結合依存的に蛋白が相互作用していると言えます。相互作用がS-S依存的かどうかで決めれるのではないかと思います。

あるいは一つのタンパク質が還元、非還元で分子内S-S結合の有無によりSDSPAGE上で、あるいはNativePAGEなど違う電気泳動システムで移動度が違うなら、そのような違いを検出することも可能です。S-S結合は蛋白相互作用だけでなく、他の分子との相互作用にも使われていると思われるのでそういう場合も応用可能であると思われます。

免疫沈降後のサンプルであれば、非還元状態であれば抗体のL鎖とH鎖の相互作用を維持したままになるので、SDSPAGE上で抗体のバンドは１５０kDaに来ます。目的のバンドがL鎖やH鎖のサイズに近く免疫沈降と同じ種の抗体で検出する場合は一つの有効な手段だと考えられています。

クロスリンカーで近くのタンパク質をつなぎとめる事によりタンパク質の相互作用を見る実験があります。クロスリンカー内にS-S結合があり非還元条件では繋ぎ止められた蛋白がはずれずに泳動され、還元状態で流せばは外れてそれぞれのタンパク質の分子量のところに移動することになります。この情報をもとにどんな実験で何が見れるのか考察してみてはどうでしょうか。


要するに還元状態、非還元状態でS-S結合をmanipulateできるわけだから、それがPAGE（変性、非変性その他の条件のもの）で反映できるなら応用可能といえます。

またSHは積極的に修飾できる訳だからそういう意味で応用可能な実験があるかもしれないと思っていると、
https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-60761-702-0_13

どんな実験ができるかということに興味があるのはいいことだとおもいます。しかしながらこれですという回答があるというよりは、応用するのは実験者のわけで（限られた範囲ではあるかもしれませんが）実験者のアイデア次第でいろいろな可能性があると思うほうがいいのかなと思います。

(無題) 削除/引用
No.9177-4 - 2020/09/25 (金) 15:36:48 - cfvgtyhu8
還元処理自体は電気泳動・ウェスタンブロッティングの原理とは直接関係ないので、しないならばしないいでもできます。この場合分子内、分子間のS-S結合は切れずにそのままですので、それを反映した分子量にシグナルが出ます。モノマーでも分子内S-Sも切断されない時や混合ジスルフィド結合とかでは分子量が少し異なる位置に泳動されることもあります。古いサンプルなどでは酸化などでランダムなS-Sが生じているような時はスメアになったりこう分子量化したりすることもあります。

レアケースではありますが、モノクローナル抗体で、非還元条件で泳動した場合だけ反応するものもありました。

(無題) 削除/引用
No.9177-3 - 2020/09/25 (金) 13:35:26 - G25
標的タンパク質がジスルフィド結合で多量体を形成するとわかっていて、多量体として検出したいとき。
あなたにその発想がないなら、少なくとも現時点で考慮すべき方法ではないでしょう。

それは 削除/引用
No.9177-2 - 2020/09/25 (金) 13:13:33 - 774R
多量体のまま測定したい場合かと

ウエスタンブロッティングの還元剤の有無 削除/引用
No.9177-1 - 2020/09/25 (金) 12:59:58 - いる７
お世話になっております。ヒト腫瘍細胞株を用いたウエスタンブロッティングを行う予定です。サンプル調整に還元剤非含有の物を用い多量体のまま測定する事があるとネットで調べたのですが、どのような場合なのでしょうか？
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