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(無題) 削除/引用 No.9163-16 - 2020/09/19 (土) 01:43:28 - おお ほんというと、あなたの試薬がワークしているかなども考えないといけないだろうし、チェックするポイントは複数あると思います。

(無題) 削除/引用 No.9163-15 - 2020/09/18 (金) 13:04:46 - AA 最初の質問に、 >>現在、pBlueScriptSK+を大腸菌のJM103にElectroporationしたサンプルを青白選択しています。IPTGとX-Galも添加して、12時間培養しています。コロニーは全て青コロニーになるはずですが、白コロニーしか出てきていないです。 と、ありますので空のプラスミドを形質転換してるのではないでしょうか。 指摘のある通り、改変済みのストックを間違って使用しているなら元も子もないので、一度中身を確認してみるのが良いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.9163-14 - 2020/09/18 (金) 12:19:23 - G25 >コロニーは全て青コロニーになるはずですが、白コロニーしか出てきていないです。もうずっとこの段階で止まってしまっており、 pBSで形質転換して全コロニーが白だからといって、どんな実験が頓挫しているのか、よくわからなかったのですが、こういうことでしょうかね、 pBSでクローニングをして青白選択をする計画で、予備実験として、あるいは対照実験として、インタクトのpBSで形質転換したんだけれど、コロニーがすべて白だった。これは一大事と、本実験をストップした。 だとしたら、本末転倒ですね。 インタクトのpBSで白コロニーしかでないということは、本実験で出てきた白コロニーは非組換え体かもしれないし組換え体かもしれない。でもいいじゃないですか。コロニーを十分な数拾えば、組換え体はきっと見つかるはずですから。青白選択のできる宿主ベクター系のほうがむしろ例外的だし、プラスミドコンストラクトづくりでは端から無理です。でもそれは通常の手技のうちです。

(無題) 削除/引用 No.9163-13 - 2020/09/18 (金) 11:33:50 - おお Transformationがうまく行っていたらその白いクローンからちゃんとプラスミドが取れると思います。そのブルースクリプトはなにか手を加えたものという可能性はないですか？

(無題) 削除/引用 No.9163-12 - 2020/09/18 (金) 09:47:05 - Skeptic 原因究明は必要に応じてなされば良いと思いますが、ブルー・ホワイトセレクションって必要ですか？私はもう何年もやっていません。

(無題) 削除/引用 No.9163-11 - 2020/09/17 (木) 16:39:15 - G25 >そこは再度調整し直してみようと思います。 老婆心ですが、今ある増殖培養済みのJM103をそのまま増やしても同じことですからね。 オリジナルのグリセロールストックがあればそこから、なければ少しでも植え継ぎ数の少ないストックから、M9培地上で選択して、シングルコロニーから増やして調製しましょう。 JM103なんて古典的な宿主、これを選んで使っている理由があるのでしょうかね？blue/white selectionをするのに最近じゃJMシリーズより、DH5alphaのようにF'非依存的な系統や、薬剤耐性でF'+を選択できるXL1-Blueのような系統のほうが主流と見えますが。

(無題) 削除/引用 No.9163-10 - 2020/09/17 (木) 16:12:34 - akirakiakira ありがとうございます。 ご指摘いただいた点、もう一度勉強し直してみます

(無題) 削除/引用 No.9163-9 - 2020/09/17 (木) 16:05:31 - G25 最初にレスで結構詳しく謎解きしたんですが、それで理解できなかったのなら、α相補性（alpha complementation)とF'について自分で勉強してからですね。 ちなみにJM103の遺伝子型は endA1 glnV44 sbcBC rpsL thi-1 Δ(lac-proAB)/ F'[traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] F因子にゲノム配列の一部が乗り換えたのがF'。 この場合F'に乗った遺伝子因子が traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15 JM109の説明だけれどJM103でも同じことだから、 https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100003496

(無題) 削除/引用 No.9163-8 - 2020/09/17 (木) 15:52:21 - G25 >もしそうであればpBlueScriptSK+が導入されていない大腸菌が増えることが予想されます。 なぜ？ >しかしプレートはLB培地にアンピシリンを添加したものを使用しているため、pBlueScriptSK+が大腸菌内に導入されていなければコロニーはそもそも出現しないのではないでしょうか。 そうですけど、なにか？

ブルーホワイトセレクションの失敗 削除/引用 No.9163-7 - 2020/09/17 (木) 15:42:27 - akirakiakira 様々なお返事ありがとうございます。 12時間培養後は低温室に保管していますが、数日経っても色に変わりはなく白色コロニーーのままでした。 宿主は過去の先輩が調整したものを使っています。そこは再度調整し直してみようと思います。 また、F’因子が落っこちたことについて別の疑問があります。 もしそうであればpBlueScriptSK+が導入されていない大腸菌が増えることが予想されます。しかしプレートはLB培地にアンピシリンを添加したものを使用しているため、pBlueScriptSK+が大腸菌内に導入されていなければコロニーはそもそも出現しないのではないでしょうか。 pBlueScriptSK+が導入されていなくても大腸菌が増殖することはあるのでしょうか？ 最近この分野に入ってきたため、こちらの勉強不足による考えであれば、どうかご指摘をお願いします。

(無題) 削除/引用 No.9163-6 - 2020/09/17 (木) 11:25:11 - おお そうですね。普通は気がつくと思うんですけど。１２時間ででてなかったからだめとか、それ以上伸ばして青になっても信用できないとか、変な思い込みがないかと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.9163-5 - 2020/09/17 (木) 10:31:18 - G25 12時間培養して結果を見て、すぐにプレートを捨てているわけではないんでしょう？ 培養時間の不足で発色していないだけだったら、冷蔵庫なり室温なりでしばらく（一晩が二晩でも）保存しているうちに青くなるべきコロニーはしっかり発色しますよ。

(無題) 削除/引用 No.9163-4 - 2020/09/17 (木) 00:55:44 - おお >12時間培養 あ、そうそうコロニー出たてのときはあまりしっかりと青く見えないことが多いです。もう少し伸ばしてみてもいいかもです。 https://blog.addgene.org/plasmids-101-blue-white-screening Don't rush the process: It is important to give your plates enough time for any intact β-galactosidase to be expressed and process x-gal into blue pigment (16-20 hours). A plate with only white colonies is very suspicious!

(無題) 削除/引用 No.9163-3 - 2020/09/17 (木) 00:45:01 - おお 原因はともかく、そこで止まっているというのが釈然としないけど。

(無題) 削除/引用 No.9163-2 - 2020/09/16 (水) 18:30:11 - G25 F’因子が落っこちた宿主を使っているということがまず最初に疑われます。 F'因子にガラクトシターゼのα相補性に必要な必要な遺伝子が載っています(lacαほか）から、F'+を選択しておかなければなりません。 宿主はどのように調製されたのもでしょうか？ 市販品ならそんなヘマはしていないと思いますが、 自作の場合、うかつなことをすると（のんべんだらりと植え継ぎを繰り返したとか、シングルコロニーを拾うときにF'因子が落ちたものを取ったとか）、F'を失ったクローンで宿主細胞を調製しかねない。 教科書的にちゃんとやるなら、最少培地であるM9 プレートにストリークしてF'+のクローンを選択したもの（F'に乗っているproABがないとプロリン要求性で最少培地では生えない）を、速やかに増殖培養して形質転換用に調製する必要があります。

ブルーホワイトセレクションの失敗 削除/引用 No.9163-1 - 2020/09/16 (水) 18:06:42 - akirakiakira 現在、pBlueScriptSK+を大腸菌のJM103にElectroporationしたサンプルを青白選択しています。IPTGとX-Galも添加して、12時間培養しています。コロニーは全て青コロニーになるはずですが、白コロニーしか出てきていないです。もうずっとこの段階で止まってしまっており、考えられる原因など、ありましたら教えて欲しいです。

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