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(無題) 削除/引用 No.9158-5 - 2020/09/15 (火) 22:19:42 - おお https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.03.023465v1.full.pdf 蛋白サイズの見積もりがブレる要因の一つに、マーカー自身も各社比較するとブレがあるという理由があります。上記の例ではアミノ酸配列からの予測で１１．６のものが使うマーカーによって１２から２２kDaのサイズに見積もられるとしています。 またアミノ酸からの計算値は細胞内でのプロセッシングや修飾を無視していますので、目安でしかありません。経験的には９kDaぐらいの計算値のものがマーカーの１０kDaよりちょっと上に来ていて、移動度が蛋白のアミノ酸配列の特徴でぶれてるのかなと思っていたら、ある時その蛋白を化学的に合成したものを流すと１０よりちょっと下にきて、細胞内ではリン酸化されているということが示されていたという経験があります。もちろんこの場合でもマーカーが絶対的とも言えませんし、分子量の計算値が絶対的とも言えません

(無題) 削除/引用 No.9158-4 - 2020/09/15 (火) 04:32:04 - おお バリアントの件ですが、あなたの購入した抗体を作るための抗原とオーバーラップしてますか？

(無題) 削除/引用 No.9158-3 - 2020/09/15 (火) 03:50:45 - おお くわえてプロテアーゼインヒビターを入れているから分解がないと思い込むのは危険性をはらんでいると思います。

(無題) 削除/引用 No.9158-2 - 2020/09/15 (火) 02:02:49 - おお SDSPAGEで見積もられる分子量は結構ブレるものです。最近の経験では２０kDaぐらいのものが１７kDaに検出されました。いろいろなメーカーのその抗体のカタログのイメージではばらつきがあり２０前後が多いものの、１７あたりに検出されてるものもありそんなものかなと思いました。 ２０以下のものであればブレ幅が大きくなってくる印象はあります。SDSPAGEが正確に分子量を反映できる保証がない方法論である以上そんなにおかしいことではないです。バッファーのバリエーションが増えているのでなおさらです。 ただしIsoformなのかなどその他の可能性には慎重になったほうがいいかもしれません。

目的タンパク質と異なる分子量の検出について 削除/引用 No.9158-1 - 2020/09/14 (月) 15:29:34 - 道なり 大変おお世話になっております。 免疫ブロッティング法の結果について質問があります。 とあるタンパク質の局在を調べるため企業から抗体を購入し、免疫ブロッティングを行っています。企業のデータシートではおおよそ20kDa付近にバンドが出現している結果が寄せられています。NCBI等のデータベースでもその分子量が正しいのですが私が実験を行うと17kDa付近にバンドが出現し、同様の抗体を用いた免疫ブロッティング結果の論文を見てみますと15kDa付近にバンドが出現していました。 自分なりに調べてみましたが、同じタンパク質のバリアントは12kDaである点からこれを検出しているとは考え難く、またprotein inhibitorを加えていることから翻訳後にタンパク質の分解等も起こっていないと考えられるのですが他に何か原因があるのでしょうか ご教授お願いいたします

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