大変お世話になっております。
先日レポータープラスミドに関して質問させて頂いた者です。
新たに疑問が生じましたので再度質問させて頂きます。
現在、このようなレポータープラスミドを作製しました。
遺伝子Aのプロモーター領域＋GFP
このプラスミドを細胞にトランスフェクションしました。
薬剤Bで遺伝子Aが活性化することが知られていますので、
薬剤Bあり、無しでGFPの発現を解析しました。
（トランスフェクション後24時間後に薬剤Bを添加。更に24時間後にGFP計測）
その結果、薬剤Bありの場合は5%ほどのGFP活性が見られ、薬剤B無しでも3%ほどのGFP活性がみられました。
最終目標として薬剤BでGFP陽性となったものだけをFACSでソートし、RNA-Seqを行いたいと考えています。
ですが、薬剤B無しでもGFP陽性がかなりいるのでこれらがバックグランドとなってしまいます。
おおさんが仰っていたとおり、GFPが安定なタンパク質なのでバックグランドが高くなっていると考えております。
GFP以外にレポータープラスミドに適した蛍光タンパク質をご存じないでしょうか？
少し調べたところ、時間ごとに色が変わるmCherryをレポータープラスミドに組み込んだり、GFPにプロテアソームの分解シグナルを付加することによって半減期を短くしている論文が見つかりました。
このような特殊な蛍光タンパク質を使ったことがある方はいらっしゃいますか？
もしおりましたらその手応え、感想等を聞かせて頂けますと大変有り難いです。
また、その他の代替案も大歓迎です。
どうぞ宜しくお願い致します。 |
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