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(無題) 削除/引用 No.914-12 - 2012/09/10 (月) 10:02:04 - XXX みなさん、多数のご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.914-11 - 2012/09/10 (月) 09:57:51 - toyo 横からのコメントで申し訳ないのですが、質問者さんの流しているサンプルは細胞溶解液なのでしょうか、それとも(十分に)精製済みのタンパクなのでしょうか？ 質問の流れからするとたぶん後者なのだろうと思いますが、SDS-PAGEとWestern Blottingとでは、検出されるバンドの特異性や感度、定量性といった点で違いがあるようですので、いつもSDS-PAGEだけで代替できるとは限らないですよね。 質問者さんもご存知だとは思いますが、サンプルや目的が質問文に含まれていなかったので、念のためコメントしておきます。

(無題) 削除/引用 No.914-10 - 2012/09/10 (月) 08:14:26 - Harmonia ぼくのやり方ですが、 ゲル電気泳動 転写 膜をponceauS染色液に浸す 蒸留水で余分な染料を落とす 顔料インクのボールペンでマーカー位置に印 TBSで染料を落とす ブロッキング 抗体処理 イメージャーでシグナル検出 そのまま可視光で膜を撮影 フォトショップで上記２画像を合成 （といっても、マーカーレーンのみ可視光画像にするだけ） 念のため、使用済み膜をCBBで染色 （通常よりかなり薄い液にする。塩梅はご自分で) 乾かした膜はハイブリバッグに入れて、実験ノートに貼る。 以上。 転写後のponceauS染色は、転写むらを発見できるという メリットがあります。 ちなみに、ぼくはプレステインマーカーは使っていません。 X線フィルムだったら、シグナル検出後に、フィルムに膜を 重ねて、マーカー位置に印を付ければ良いです。

(無題) 削除/引用 No.914-9 - 2012/09/10 (月) 04:14:05 - おお >イメージを取り込んだ後のメンブレンを染色すればよいのでしょうか？ これも出来なくはないです。トランスファー直後のほうが染色がきれいだという印象があります。

(無題) 削除/引用 No.914-8 - 2012/09/10 (月) 04:10:56 - おお つかっている膜がニトロセルロースかPVDFかで若干プレファレンスがちがいますので、そのへんはよく調べてみてください。

(無題) 削除/引用 No.914-7 - 2012/09/10 (月) 04:09:35 - おお 追加です。いっぺんにホームページのリンクをつけると受け付けてくれないことがあるので、、、 http://www.youtube.com/watch?v=Jj_37cDsO7o ここにも載っていたと思いますがいまひらけません。 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471140864.ps1008s00/full

(無題) 削除/引用 No.914-6 - 2012/09/10 (月) 04:07:32 - おお >というのは、W.B.のメンブレンを、SDS-PAGEでゲルを染めるようにCBBで染色できるということでしょうか？ そうです。CBBは示したハンドブックではimmunoblotに若干影響があるという記述がありますが、使っている人もいると思います。CBBでなくほかの色素ponceauSを私はよく使いますが(ハンドブックにもやり方がのってますが、染色ごの洗じょうは水かPBSTをつかってます、ハンドブックでは0。1%水酸化ナトリウム)、感度に影響がでるような感触はありません。そのほかにもいくつか違う色素が使えます。もしかしたら蛍光で染める類のものも使えるかもしれません。 まあある程度しっかりとしたプロトコール集にはこれらのことについて記述がありますのす(ミリポアはPDFでまくてホームページ上でも可也詳しく書いてたと思いますが今ちょっとみつかりません)。記述によって若干書いていることにブレがあるかもしれませんけど。 >その場合、HRP標識抗体と発光気質を用いて、イメージャーで可視化する場合に影響はないのでしょうか？ http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p7170?lang=en&region=US

(無題) 削除/引用 No.914-5 - 2012/09/10 (月) 02:40:08 - XXX お二方、ご返答頂きありがとうございます。 参考文献にしっかり目を通していない上での質問となり失礼とは思いますが、 おおさんにお聞きしてもよろしいでしょうか？ >もう一つはのやり方は分子量マーカーも膜に転写して膜を一度そめて、トータルのタンパクを染めてイメージを得ると良いでしょう。分子量マーカーも染まるので、染まったマーカーの位置を柔らかい鉛筆などでマークしておけば、膜上のマーカーの位置は染めた色素を洗い流したあとでも残ります。 というのは、W.B.のメンブレンを、SDS-PAGEでゲルを染めるようにCBBで染色できるということでしょうか？ その場合、HRP標識抗体と発光気質を用いて、イメージャーで可視化する場合に影響はないのでしょうか？ それとも、イメージを取り込んだ後のメンブレンを染色すればよいのでしょうか？ 質問が重なってしまい申し訳ありません。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.914-4 - 2012/09/10 (月) 02:29:55 - おお 蛇足ですが、プレステインマーカーがなかった時はどうしていたか想像してみてください。古いメソドロジーを書いた文献とかもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.914-3 - 2012/09/10 (月) 02:19:31 - あかね 私もおおさんと同意見です。 WB用の分子量マーカーを使用するのもいいですが、それ程westernをする頻度が高くないなら、同僚の方が教えてくれた方法は経済的で悪くないと思います。

(無題) 削除/引用 No.914-2 - 2012/09/10 (月) 02:14:36 - おお 効率などの問題とかあるかもしれませんが、間違った解釈を導くものでなければ、間違っていないです。言い換えると書かれたどのやり方でもOKでしょう(ただし"SDSーPAGEの分子量マーカーの位置を、ポジコンのバンドを頼りに照らし合わせるという"の記述がどういうことか具体的に不明ですが)。2枚のゲルをつかっていて一つがSDSPAGE、他方がWBなら、ゲルのコンディションでぶれがきになるところです。 おそらくマーカーはプレステインではないものをつかってるかとおもいます。SDSPAGEで分子量マーカーのレーンだけ切取り、CBBなどで染め、WBの結果と合わせるのもてかと思います。もう一つはのやり方は分子量マーカーも膜に転写して膜を一度そめて、トータルのタンパクを染めてイメージを得ると良いでしょう。分子量マーカーも染まるので、染まったマーカーの位置を柔らかい鉛筆などでマークしておけば、膜上のマーカーの位置は染めた色素を洗い流したあとでも残ります。 蛇足ですが膜上にしろ、ゲル上にしろ、トータルのタンパク質のイメージをきーぷしておくのは理想的だと思います。サンプルの状態、あプライした量の誤差など確認できるわけですし、アクチンなどのインターナルコントロールの代わりとして示すことができると思いますし。 膜の染め方は以下を参照してください http://www.millipore.com/techpublications/tech1/tp001en00 Ponceau Amido black CBB などで膜を直接染めることができます。わたしはよくPonceauを使ってトランスファーごすぐ染めてからWBをします。

SDS-PAG and/or W.B. 削除/引用 No.914-1 - 2012/09/10 (月) 01:13:29 - XXX 当方、先日SDS-PAGEとwestern blottingを人より教わったのですが、その際、これらを同時にやるようにと教わりました。 というのも、当Lab.にはW.B.に使える分子量マーカーがなく、W.B.で最終的に化学発光させた結果とSDS-PAGEの分子量マーカーの位置を、ポジコンのバンドを頼りに照らし合わせるという、意味の分からない作業を行っているからであります。 正直、このようなことをしなければいけないことに意味があるとは思えず、W.B.で使える分子量マーカーさえ用意すれば、W.B.のみを行うのでいいと思うのですが、この考えは正しいといえるのでしょうか？ 本来、sdsやW.B.をルーチンで行うLab.ではなく、しっかりとした指導者もいないため、この場で質問させていただきました。 よろしくお願いいたします。

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