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(無題) 削除/引用 No.9134-11 - 2020/09/04 (金) 08:24:17 - 初心者 なるほど、ありがとうございました。 大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.9134-10 - 2020/09/03 (木) 21:20:58 - G25 ライゲーション末端同士をリン酸ジエステル結合で共有結合することです。 私が説明したのは、付着末端同士の水素結合で繋がっている状態のことで、共有結合していません。鎖の連続性はいわゆるニックNickによって分断されたまま。 > 例えば制限酵素の切断末端が3塩基のオーバーハングだとすると、3塩基全部ではなく1つだけが相手と水素結合で繋がって「首の皮一枚繋がっている出来損ないの環状化」とか、そういうことでしょうか。 違います。 付着末端は4ヌクレオチドなら4ヌクレオチドが相補配列であって対合、水素結合します。でもライゲーションしなければ共有結合で連結されません。 そもそも一塩基対だけの水素結合では不安定すぎて首の皮一枚でもつなぎとめられない。

(無題) 削除/引用 No.9134-9 - 2020/09/03 (木) 19:56:20 - 初心者 お願いついでにご教授いただければと思います。 G25 さんが書かれている自己環状化とセルフライゲーションは何が違うのでしょうか。 ここでおっしゃっているところの環状化とは、例えば制限酵素の切断末端が3塩基のオーバーハングだとすると、3塩基全部ではなく1つだけが相手と水素結合で繋がって「首の皮一枚繋がっている出来損ないの環状化」とか、そういうことでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9134-8 - 2020/09/03 (木) 16:25:39 - おお >[Re:5] Skepticさんは書きました : > まさかそんなことはあるまいと、どなたも端から考慮されていませんが、質問者さんはもしかして、ligaseを使ったligation反応を行なわなくとも、linearなプラスミドを-20℃で長期間保存しておくだけでセルフライゲーションされるのではないかとお尋ねだったのでしょうか？ わたしももしかしたらそういう質問かもしれないと頭の片隅によぎったので、Lagationをしてと書いて、質問者からの誤解してますよというツッコミ待ちをしてました。

(無題) 削除/引用 No.9134-7 - 2020/09/03 (木) 14:56:49 - G25 保存中のDNA断片が自発反応でライゲーションを起こすことはありません。 ライゲーションは吸エネルギー反応で、 エネルギー供与体のATPと、もちろん酵素 (ligase)が必要です。繰り返しますが、自発反応は起こりません。 ライゲーションは起こりませんが、付着末端である場合、それが4塩基長くらいだとしても、長期保存中に水素結合で再環状化している可能性はあります。取り出して大腸菌に導入したら、純粋なリニアよりも形質転換効率が上がるかもしれません。 実際に問題になるのは、インサートを加えた普通のライゲーション反応のとき、そのように水素結合で再環状化しているベクターは、そのままセルフライゲーションしてしまう確率が高く、バックグラウンドを上げるということです。 一般的に、制限酵素処理済みのベクターを保存して使うときは、使用直前に、温和に加熱（例えば50℃）して付着末端の水素結合を解除してやります。 あと、付着末端だろうと平滑末端だろうと、保存中に末端が（コンタミした）酵素的あるいは非酵素的に削れていて品質が落ちているおそれがある、ということは念頭においたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9134-6 - 2020/09/03 (木) 14:29:14 - 初心者 skeptic さんがおっしゃる通りです。一定の割合で self ligation が起きているのならその溶液をそのまま大腸菌に入れて増やし直して切り直しし、改めて脱リン酸化して使おうとしています。

(無題) 削除/引用 No.9134-5 - 2020/09/03 (木) 12:38:00 - Skeptic まさかそんなことはあるまいと、どなたも端から考慮されていませんが、質問者さんはもしかして、ligaseを使ったligation反応を行なわなくとも、linearなプラスミドを-20℃で長期間保存しておくだけでセルフライゲーションされるのではないかとお尋ねだったのでしょうか？ だとしたら、そんなことは起こりませんのでご心配は無用です。

(無題) 削除/引用 No.9134-4 - 2020/09/03 (木) 12:14:38 - AA 老婆心ながら・・・ 数年前に切ったという点は無視しても、脱リン酸化していない1cutプラスミドをライゲーション試薬と混ぜたら、基本的に殆どがセルフライゲーションになると思います。 また、1cutでインサートを入れようとすると、向きも、個数もコントロールできないのであまりおすすめできません。 一旦セルフライゲーションさせてそれを増やしてシークエンス確認してから再度2cutなりhomology directedなりの方法でクローニングされることをおすすめいたします。 実際、うまくいかなければバックボーンプラスミドは今後の作業で再度必要になるはずなので増やしておいて損は無いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9134-3 - 2020/09/03 (木) 11:11:50 - 初心者 ありがとうございます。ばっちり切れたまま残っているならそのままフラグメントを入れて使用したいのですが、環状に戻ってしまっているなら大腸菌で増やし直して制限酵素でカット後、脱リン酸化したものを作り直して使おうと思っていました。 この目的ですので、コロニーがぱらぱらと見える以上の個数あれば十分なので、後者の方法でやってみます。

(無題) 削除/引用 No.9134-2 - 2020/09/03 (木) 10:42:05 - おお Ligationすると「結構」はえるとおもいます。ただしあなたが考えている「結構」と一致しているかはわかりません。 ベクターを大量の量カットしてアルフォス処理してサブクローニングように保存していて数十年保存している人がいます。

オープンベクターのセルフライゲーション 削除/引用 No.9134-1 - 2020/09/03 (木) 10:30:31 - 初心者 プラスミドを１種類の制限酵素で切って linear にし、脱リン酸化処理することなく-20℃で数年間保存していた場合、どのくらいの頻度でセルフライゲーションするでしょうか。コンピテント細胞に入れたら結構コロニーが取れるくらい生えるでしょうか。

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