BioTechnicalフォーラム [ベクターの選び方]

ベクターの選び方

No.9132-TOPIC - 2020/09/02 (水) 22:18:55 - a

人工DNAの合成と合成DNAをベクターに入れてもらえるサービスを利用しようと思っています。ベクター選択の際の基本的な考え方を教えていただけないでしょうか。

約300bpのDNAを挿入予定です。60アミノ酸ほどのタンパクを最低1mg精製したいです。

アンピシリン耐性(pUC系)　pIDTSMART-AMP・pUCIDT-AMP
アンピシリン耐性(pBlueScript系)　pIDTBlue
カナマイシン耐性(pUC系)　pIDTSMART-KAN・pUCIDT-KAN

を選択可能とありました。
それぞれのベクターについて調べてみたのですが、注目すべきところがわかりません。

選択の際に考えなければいけないこと、それぞれのベクターの特徴、アンピシリン耐性とカナマイシン耐性どちらが良いのか、これらについて教えていただけますと幸いです。
　

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(無題)

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No.9132-7 - 2020/09/08 (火) 17:48:27 - 25

遺伝子操作について詳しいわけではないので恐縮ですが
当研究室において、Expi293細胞にトランスフェクションしてタンパク質を精製する際のプラスミドとして
pCAGGSベクターを用いたものを使用しています。
タンパク質精製に用いられるものとしか知識を持ち合わせておりませんが、一応参考になればと…
https://www.yodosha.co.jp/bookdata/9784758101752/9784758101752_02.pdf

タンパク質や細胞の種類、細胞数によってまちまちだとは思いますが
当研究室ではmgオーダーで精製タンパク質を得ることができています。

(無題)

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No.9132-6 - 2020/09/03 (木) 18:16:52 - G25

>BlueScript系について、RNA合成がプラスミドからできる、ということはどういうことですか?タンパク発現までできるということではありませんよね？どういうメリットがあるのでしょうか

in vitro transcripion/translation系で無細胞タンパク質合成をやるのにもつかえるな。

(無題)

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No.9132-5 - 2020/09/03 (木) 16:42:30 - おお

>[Re:3] aさんは書きました :
> おお　さん

> ・BlueScript系について、RNA合成がプラスミドからできる、ということはどういうことですか?タンパク発現までできるということではありませんよね？どういうメリットがあるのでしょうか。

RNAプローブを作るというのはすでに指摘がありますが、平たく言うとRNAメタボリズムを調べるときのRNAを合成したりもします（スプライシング、エディティング、Modification、その他プロセッシング、RNA結合蛋白とRNAとの相互作用、RNA自体の構造の研究）。まんまるの細胞にRNAをTransfectionすることがありますが、そういうときもRNA合成をプラスミドからすることもあります。

もちろんRNA合成して、そのRNAから蛋白を合成する系もあります。でもそのためにはリボソームがFirst Metを認識できるような配列をRNAに仕組んでおく必要があります。

(無題)

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No.9132-4 - 2020/09/03 (木) 12:06:02 - AA

>>RNA合成がプラスミドからできる
例えばin situ hybridizationのDIGラベルプローブ合成などで鋳型として使えます。

>>挿入されたランダム配列の数の違いとはDNA発現の効率
メーカーのプラスミドが発現プラスミドではなく、そこから載せ替える必要があるのであれば関係ありません。
例えば、依頼者がバックボーンプラスミドを送ってそこにクローニングして貰う場合は、プロモーターとORFの間に挟まると影響が生じる可能性もあると思います。
(カスタムプラスミド使用、とかそんな表現がされるオプションになると思います。)

>>、付加した制限酵素サイトの両端に余剰配列を入れる必要性
おそらくクローニング用PCRなどで認識配列外側に余剰配列をつけることを言っているのだと思います。これは、制限酵素がDNA断片の断端近辺にある配列を認識しにくいことに対して行う作業ですが、プラスミド中の配列であれば断端が存在しないのでこういった作業は不要になります。(バックボーンプラスミドの配列がそのまま余剰配列になります)

(無題)

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No.9132-3 - 2020/09/03 (木) 11:27:00 - a

おお　さん

知りたかったことを的確に回答していただけてとてもすっきりしています。サイトまで確認していただきお手数をおかけいたしました。非常に分かりやすかったです。

素人質問で恐縮なのですが、もう何点か教えていただけないでしょうか...?

・BlueScript系について、RNA合成がプラスミドからできる、ということはどういうことですか?タンパク発現までできるということではありませんよね？どういうメリットがあるのでしょうか。

・「依頼のDNA配列と上記のプラスミドとの間には、ランダムな配列が挿入」とありました。それぞれのベクターで、挿入されたランダム配列の数が違うようです。この数の違いはDNA発現の効率か何かに影響を与えるのでしょうか。

クローニング用ベクターと発現ベクターが存在することを理解しておりませんでした。また、MCSについてもご指摘ありがとうございます。

・塩基配列をベクターに入れてもらう際、付加した制限酵素サイトの両端に余剰配列を入れる必要はあるのでしょうか？それとも、制限酵素サイトの配列からで良いのでしょうか。いきなり制限酵素サイトの配列だと、切れにくくなるのではないかと思ってしまいます。上の質問の通り、ランダム配列が挿入されているようなので、必要はないでしょうか？

(無題)

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No.9132-2 - 2020/09/03 (木) 04:22:08 - おお

ぱっとマップを見たところお示しのプラスミドはすべてペプチド発現用ではないですね（メーカーに確認、相談してください何らかのオプションがあるかもしれませんし）。

pUC系は単なるクローニングベクターと思っていいでしょう。とりあえず遺伝子を入れてプラスミドでそのDNAを保存するためのもの。pUC系といえどある程度機能的なものはあるけどInsertが入った状態などではLacZはあまり関係ないし（これはブルースクリプトも同様）、M13の配列からSingle strand DNAが作れるけど、そういうのが必要な実験だと思えないし。

BlueScript系はT7とT3プロモーターがついているのでRNA合成がプラスミドからできます。

両方の系はOriはほぼ一緒の性質なのでその点ではどちらでも変わらないでしょう。

AmpとKmはどちらもプラスミドを増やすにおいて違いを感じません。Ampは耐性遺伝子産物により比較的速やかに分解されるので、長期培養でプラスミドが抜けやすくなったりするかもしれませんが、通常のプラスミド精製、サブクローニングなどでは遜色なく働きます。Ampは熱に弱いので培地を作るときは要注意ですが、Kmはそこまでセンシティブではありません。

いずれにしろ発現ベクターではないので移し替えをしないといけないと思いますが、移し替える先のベクターの薬剤耐性が今回の合成で作るベクターと違うほうが移し替えで楽ができる可能性があります。違う薬剤耐性じゃないとできない特殊なやり方もありますが、今回のベクターでは多分できないでしょう。

たしかIDTのホームページではMCSは潰れていてあなたの遺伝子はあなたが末端に制限酵素認識配列をつけないと切り出せないようになっているようです。もしお気づきでなければ一度確認してみてください。

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No.9132-1 - 2020/09/02 (水) 22:18:55 - a

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