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(無題) 削除/引用 No.9129-6 - 2020/09/15 (火) 03:47:28 - おお >[Re:5] Eragonさんは書きました : > ureaも購入したので、準備進めています。 > ただ、濃縮と分離の間で問題が起こっているみたいなので、その間がない、グラジエントゲルもどうかなと思っているのですが、いかがでしょうか。 濃縮ゲルでは分子量が相当大きくても通過できるようになっているので濃縮ゲルと分離ゲルの間でアグったものがそこでスタックしてしまうことは結構あります。問題が起こっているかどうかより通過できる分子のサイズの問題である可能性が高いと個人的には思っています。 グラジエントゲルもスタッキングがあるのが基本だと思いますが、ない物があるのですか？プレキャストでそのようなものがあるのですか？ http://www.ispybio.com/search/protocols/sds%20protocol26.pdf 3.For 80 ml multi-caster system and 4-10% gels, combine the following in 50-mlconical tubes and invert a few times to mix well:....... 11.Once gels are solidified pour off the butanol, rinse tops of gels with distilled water,drain off (can dry by inserting filter paper). Then mix up stacker:

(無題) 削除/引用 No.9129-5 - 2020/09/15 (火) 02:02:47 - Eragon ureaも購入したので、準備進めています。 ただ、濃縮と分離の間で問題が起こっているみたいなので、その間がない、グラジエントゲルもどうかなと思っているのですが、いかがでしょうか。 他の人たちはグラジントゲルでやったと論文には記載されています。 Laemmli系でうまくいかないが、グラジンエントゲルだとうまくいくなんてことはありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9129-4 - 2020/09/15 (火) 01:58:31 - Eragon 凍結融解をすると濃縮ゲルと分離ゲルで詰まっているようなバンドが薄くなり、目的の位置に移動していくので、凍結融解自体はこの実験系においてpositiveな役割をしていると考えています。 逆に凍結融解をしない場合は目的の位置にバンドが出ません。 ヨードアセトアミドは面白そうですね。早速試してみたいです。 ありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.9129-3 - 2020/09/04 (金) 01:13:00 - q１亜２s３d４f５gt６hy７じ 再融解を繰り返すにつれということなので、還元剤の効果が酸化されてだんだん低下して、還元されて切れたジスルフィド結合がランダムに再結合してるように思います。そのタンパク質はCys残基の数が多くないでしょうか。泳動前にbe-taMEを追加で添加すると多分そういうことはなくなると思いますが、毎回するのもアレなので、DTTで還元処理したのちヨードアセトアミド加えて処理してシステインをアルキル化して再酸化しないようにしておけば防げると思います。 ただ簡単で一番いいのは分注して再融解の頻度を最小に止めるなどの工夫をすることです。

(無題) 削除/引用 No.9129-2 - 2020/09/02 (水) 03:30:41 - おお その蛋白がアグリやすい性質をもっていて、アグったものが分離ゲルの境界でスタックしてしまったかもしれません。多少薄くなってもいいなら水で飽和したUrea（大体１０ー１１M、室温で）を流す直前に等量加えて見てください。Ureaはcarbamylationを起こすので長期保存や加熱は避けたほうがいいです。還元剤が気になるならDTTか２MEを加えておいても構わないです。 サンプルをこれ以上希釈したくないのなら、ゲルを作るとき５M以上のUreaを含むゲルにするといいです。 分離ゲルでもスタッキングゲルでもいいですが、分離ゲルだと泳動後Ureaを抜いたほうがいいです。スタッキングゲルOnlyでもいいですが、LoadingのときUreaが滲み出てくるのでWellないのバッファーのDensityが時間とともに高くなります。いずれにしろ注意が必要です。 もっと扱いやすいのは分離ゲルとスタッキングゲルの間にUreaを含むスペーサーゲルを挟むことです。５ミリぐらいあればいいかと思います。

SDS PAGEについて 削除/引用 No.9129-1 - 2020/09/01 (火) 23:04:23 - Eragon Western blottingにて分子量が正しく出ないというか濃縮ゲルと分離ゲルのあたりに目的のタンパク質が出てしまい、困っています。 凍結融解を繰り返したりすると目的の位置にバンドがシフトしていくので、濃縮ゲルと分離ゲルの境界位置のバンドも非特異的な結合でないと考えられるのですが、いかがでしょうか。 考えられる原因としては分離ゲルに入った際に還元が弱まり、SS bondが復活してしまうとか考えているのですが、そんなことはあり得るのでしょうか?

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