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(無題) 削除/引用 No.9127-4 - 2020/09/05 (土) 11:53:01 - M キットのビオチン化抗lineage抗体で染色した後、蛍光標識されたストレプトアビジンで染色して、Lin(-/low)cKit(+)細胞と、Lin(-/low)cKit+Sca1+CD150+CD48-造血幹細胞における、Linマーカーの染まり具合を比較して下さい。 造血幹細胞においてはLin(-)よりLin(low)の方が優位になっていて、cKit細胞ではLin(-)が優位なのであれば、お考えの仮説がmost likelyと思われます。この場合は、abcさんがおっしゃるように、Linマーカーの中に造血幹細胞と弱く結合する抗体が入っていると思われ、これを同定して除けば良いと思います。もしStem Cell TechnologiesのEasySepを使っているなら、CD5, CD11b, CD19, B220, Gr1, TER119, 7/4がLinマーカーとして入ってますね。 もし、造血幹細胞とcKit細胞で、Linマーカーの染まり方が同様であれば、濃縮率の差は他の理由と考えられます。一回ビーズでのpre-enrichmentあるなしでソートして、回収細胞数や幹細胞機能を比較して見ると面白いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.9127-3 - 2020/09/04 (金) 11:27:32 - abc 一個書きわすれました。 anti-CD16/32 biotin も分画によっては使用可能です。LT-HSC での発現をお調べのうえ、ご検討ください。

(無題) 削除/引用 No.9127-2 - 2020/09/04 (金) 11:23:45 - abc こんにちは。今ちょうどマウス骨髄細胞のネガティブ磁気ビーズセレクションをしています。しかし私の標的は幹細胞ではないので、あくまでテストしていない内容を記述します。ご了承ください。 もし FACS でご覧になっている LT-HSC 分画すべて回収したいなら、現在用いているビオチン化抗体をどれか一個外した標識パターンを全パターン試し、どれが一番 LT-HSC の細胞数が保存される標識パターンかを明らかにすることになると思います。 しかし一般的に磁気ビーズで行う以上、lineage depletion をするのは前提だと思います。そのうえで、さらに目的の分画が発現していない抗原に対するビオチン化抗体を加え、要らない HSPC を除去すれば LT-HSC がより純化される可能性があります。 まず、LT-HSC は恐らく Kit+Sca1+ 分画にあると思います。このうち、ST-HSCと MPPが CD34陽性だとすると、anti-CD34 biotin をセレクションに加えられるかもしれません。 さらに、Kit+Sca1- 細胞は Kit+Sca1+ 細胞より多数です。Kit+Sca1- 分画には、CMP (CD34+CD16/32-)、GMP (CD34+CD16/32+)、MEP (CD34-CD16/32-) が存在します。したがい、anti-CD34 biotin は ST-HSC、MPPに加え CMP、GMP の除去にも効果があります。MEP を除去したい場合には anti-CD71 biotin が使えるかもしれません。CD71はトランスフェリン受容体であり、赤血球産生に関わります。しかしながら、LT-HSC が CD71 を全く発現していないかどうかは、調べていないのでご確認ください。さらに他の HSPC マーカーを詳細にお調べになることをおすすめします。 磁気ビーズのネガティブセレクションによる純化は限界があり、上記の方法でもまだ除去できない分画があります。非常に高い純度が必要な場合は、FACS (Ariaなど) が必要になります。

骨髄のlineage depletionについて (フローサイトメトリー) 削除/引用 No.9127-1 - 2020/09/01 (火) 15:24:13 - 造血幹細胞 骨髄のlineage depletionについてお伺いしたいことがあり、書き込み致しました。 私はマウスの骨髄から造血幹細胞 (LT-HSCs)のソーティングを計画しています。 これまでいくつかのマウスの骨髄のマルチカラーフロー解析はルーチンで行ってきましたが、ソーティングを行い、RNAを解析することになりました。施設にはシングルセル用のものがありませんので、ソーティングをしてLT-HSCsを得なくてはなりません。 そこでまずlineage depletionを行うために、Stem Cell Technologiesからmouse lineage depletion kitを購入し、骨髄細胞をビオチン化抗lineage抗体で染め、その後、ストレプトアビジンマグネットにてlineage depletionを行いました。 結果は確かにlineage陰性cKit陽性の分画が25倍ほぼ濃縮していましたが、肝心のLT-HSCsは5倍程度にしか濃縮していませんでした。これはおそらくlineage depletionの際にLT-HSCsもいくらか覗かれてしまっているのではないか、と考えています。といいますのも、これまでマルチカラー解析していた際に気づいていたことですが、lineage陰性cKit陽性にLT-HSCが含まれるとはいっても、lineageは全く陰性というわけではなく、FMOコントロールに比べしっかりlineage抗体で染まっているようです。 となると、やはり磁気ビーズで除かれてしまうと思います。 書き込みを見てくださった方の中でlineageを除き、マイナーな分画のソートをされておられる方がいらっしゃいましたら、何がコツや気をつけるべき点がありましたらご教授いただけますと幸いです。

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