全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9112-19 - 2020/09/11 (金) 21:49:08 - あああ >[Re:18] G25さんは書きました : > 最近、多くのシリカ系の製品はsoln 3相当の液にグアニジンが入っているものが多いと思います。 > グアニジンでエンドトキシンなどの不純物を除くとともに、DNAとシリカの塩橋形成にも一役買っているのではないかと思っていますが。 バッファーを自作しているブログ記事などを見つけ、確かに、ポケットマニュアルのものと違いました。グアニジンが入っていました。 自分で調整したとして、その最適化の手間なども考えると、キット自体を買い直した方が早いという結論になりました。 > > KOAcバッファーのsoln 3であれば長期保存で劣化するようなものじゃなるまいし。グアニジンが分解してアンモニアでもできてpHが上がったか？ もしかするとですが、初歩的な操作ミスかもしれないと思っています。 全部の液が無色透明で、ボトルの形も全く同じで、文字の記載も小さいキットなので、アルカリ化が終わった後に、中和しようと思って、ピペットエイドで液を吸ったところ、「あれ、これ溶液２だ。間違えた、溶液3を取り直さなきゃ」ということが一度ありました。 そのときもしかすると溶液2を誤って蓋が空いていた溶液3のボトルに入れてしまったのではないか？という可能性を考えています。それでボトル内で勝手に中和されて、溶液3のpHが上がってしまったのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9112-18 - 2020/09/11 (金) 15:28:14 - G25 >バイオ試薬調整ポケットマニュアルに従って、酢酸カリウムと酢酸で中和液を自作してみようと思います。 シリカマトリックスなどのカラムで精製する系をお使いだと思いますが、 各溶液の組成は製品によって異なると思っておいたほうがいいです。 また、実験書にあるようなhome-madeのAlkali/SDS ,methodとも違っているはずです。 最近、多くのシリカ系の製品はsoln 3相当の液にグアニジンが入っているものが多いと思います。 グアニジンでエンドトキシンなどの不純物を除くとともに、DNAとシリカの塩橋形成にも一役買っているのではないかと思っていますが。 KOAcバッファーのsoln 3であれば長期保存で劣化するようなものじゃなるまいし。グアニジンが分解してアンモニアでもできてpHが上がったか？

(無題) 削除/引用 No.9112-17 - 2020/09/09 (水) 10:42:38 - あああ 皆様ありがとうございます。 他のminiprepキットで溶液を交差させて使って段階を踏んで、原因を特定していったところ、中和液がダメになっているということが分かりました。そのせいで、中和が上手くいかずに、上手く混ざらず、膜状になったり、プラスミドが全く回収できないということだったようです。これまで、何度かトラブルがありましたが、今回のようなパターンは初めてだったので、このようなこともあるのだなあと勉強になりました。 バイオ試薬調整ポケットマニュアルに従って、酢酸カリウムと酢酸で中和液を自作してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.9112-16 - 2020/09/05 (土) 06:47:18 - べれべれ 僕もプラスミド抽出していてしばしば袋状の画分ができることがあるので、丁寧にやる暇のあるときはピペットマンのチップなどで突いて穴をあけてます。

(無題) 削除/引用 No.9112-15 - 2020/08/30 (日) 10:19:21 - あああ そういえば、試薬調整のポケット本にアルカリSDSのレシピが載っていた気がします。探してみます。

(無題) 削除/引用 No.9112-14 - 2020/08/29 (土) 23:29:54 - しおりん pHメーターの測定可能なpHレンジを超えている気がしますが。 組成はシンプルなので簡単に自作できますよ。

(無題) 削除/引用 No.9112-13 - 2020/08/29 (土) 14:50:52 - あああ 一度残っているアルカリSDSのpHを測定してみるというのはどうでしょう。劣化しているかどうかの判断の参考になるでしょうか？ プラスミド抽出キットを買い直してみることも考えているのですが、アルカリSDS、中和液だけを販売しているところとかご存じないですか？カラムや溶出駅は大量に余っているもので…。 あるいはpHが下がってしまったアルカリSDSを再生できる方法などないでしょうか？ 色々質問してしまいすみません。

(無題) 削除/引用 No.9112-12 - 2020/08/28 (金) 22:49:27 - あああ ありがとうございます。 いくつか疑うべき点はありそうですが、転倒混和が不十分で中和がうまくいっていないのか、あるいはアルカリSDSが劣化してアルカリ化→中和がうまくいっていないのか。 あるいはその手前の溶菌の問題か…。 βラクタマーゼの問題については以前、私もこちらの掲示板で質問させていただいた一人で、それ以来、前培養の時間は日中だけにしてフラスコ培養に移る前に500g5minで遠心して、上清を除いて、きれいなLB-ampで再懸濁してから移すようにしています。

(無題) 削除/引用 No.9112-11 - 2020/08/28 (金) 22:29:48 - G25 アルカリSDS溶液は、保存中に炭酸で中和されてpHが下がります。 古い論文で研究されてるようにベストなpHnの範囲はかなり狭くて、本来なら要時調製すべきもの。市販品は密封で出荷するため、あるいはpHを高めに設定しているため、多少長持ちする様になっているようです。

(無題) 削除/引用 No.9112-10 - 2020/08/28 (金) 22:21:30 - Skeptic 追加のお話をうかがって、中和のステップの混和が不十分であるのが原因でまず間違いないと思います。穏やかに混ぜるべきというのはその通りですが、いつも同じに転倒混和するんじゃなくて、目で見て一様になっているのを確認しながらの方が良いでしょう。 大きいスケールに移したときに収量が落ちるのはいろいろな場合がありますが、この掲示板でこれまでも頻出したケースは、種菌としてオーバーナイトカルチャーを植菌することです。オーバーナイトカルチャーには分泌されたβラクタマーゼが山ほど含まれているので、1/100容も本培養に加えたらアンピシリンがすぐに分解されて選択は一切かかっていません。1/1000容でもヤバいです。大腸菌の生育に問題がないプラスミドなら、それでもプラスミドが本来備えている安定な分配機構で分裂を繰り返しても問題なく受け継がれますが、生育を下げるようなプラスミドだと、培養はたちまちプラスミドを落とした菌に乗っ取られます。

(無題) 削除/引用 No.9112-9 - 2020/08/28 (金) 21:54:30 - あああ すみません。懸濁するのは「細胞」ではなく「大腸菌」の書き間違いでした。

(無題) 削除/引用 No.9112-8 - 2020/08/28 (金) 21:53:01 - あああ ありがとうございます。 細胞の懸濁は完全に塊がなくって、均一な液状になるまでボルテックスはかけていますが、リゾチーム処理はしていません。もしかして十分に溶菌できていないの原因でしょうか。 maxiprepは1年ほど前に購入して、懸濁液、アルカリ化液、中和液は使用しながらそれぞれ4℃と室温に保存しています。それらの試薬やカラムが劣化して収量が低下しているということは考えにくいですよね？

(無題) 削除/引用 No.9112-7 - 2020/08/28 (金) 21:04:10 - G25 2、3往復、転倒混和すれば十分だと思います。それ以上やっても良くも悪くもならない。 スケールが大きくなったとき、一番、効率が下がるのは溶菌のところだと思います。 アルカリSDS液を加える前に、よく懸濁すること、Lysozyme処理のステップを加えることで改善が期待されます。 今は省略することが普通ですが、かつてはスモールスケールでもアルカリ溶菌の前にLysozome処理するのが常法でした。しかし今でも大きいスケールではLysozyme処理をした方がいいと言われています。

(無題) 削除/引用 No.9112-6 - 2020/08/28 (金) 19:34:27 - あああ ちなみに最近、maxiprepで思うようにプラスミドの収量が上がらない、ひどいときにはほとんど取れないということもあるのですが、アルカリ化、中和のステップがうまくいってなくて、収量が著しく低下するということはあり得るでしょうか？ プラスミドをヒートショックで導入したばかりのDh5αをプレートで培養。翌朝にコロニーピックアップ、カルチャーチューブで培養して、夕方に一部miniprepして、泳動して、バンドを確認。 問題ないことを確認してから、フラスコ培養して、翌朝、目視で濁っていることを確認して、maxiprepという流れで行っています。

(無題) 削除/引用 No.9112-5 - 2020/08/28 (金) 19:13:47 - あああ すみません。確かに〇形質転換、×形質導入ですね。 中和の際、ゲノムDNAがせん断されて混入してしまうのが怖くて、かなり穏やかに転倒混和しています。それで十分に中和できていないのが、原因でしょうか。次回はもう少し、強めに上下に振ってみたりしてみます。 クロロホルムの添加も試してみます。

(無題) 削除/引用 No.9112-4 - 2020/08/28 (金) 09:21:20 - Skeptic 中和溶液を加えた後に十分に混合されていないせいだと思います。変性したタンパク質等が溶液の一部の表面を覆ってしまって、アイスクリームの天ぷらみたいな状態。

(無題) 削除/引用 No.9112-3 - 2020/08/27 (木) 17:10:27 - G25 それと細かいことだけど、 大腸菌にプラスミドを入れることは形質導入（transduction)とは言いません。形質転換（transformation)です。なぜそう呼ぶか、なぜ呼び分けられているのかは、用語は多分に歴史的経緯から生まれるものだからです。

(無題) 削除/引用 No.9112-2 - 2020/08/27 (木) 17:07:45 - G25 >ゲノムDNAとか変性したタンパク質のペレットができると思いますが、一部、膜で包まれたような液性の部分ができます。 これがどういう状態なのかよくわかりません。 oil-in-waterのようなものでしょうか。 それともペレッの隙間に溶液の一部が封じ込められているということでしょうか。 何れにせよ、今まで、そう言う風になった経験はないように思います。 その問題に有効かどうかわかりませんが、 塩析後の不溶化物はふわふわしていて、遠心してもしっかりパックされないので、リキッドハンドリングの妨げになりがちです。 よく知られたテクニカルチップですが、このとき少量（例えばスモールスケールなら50 uL程度）のクロロホルムを垂らしておくと、不溶物がクロロホルムと水層の界面付近に集まってしっかりパックされるので水層の回収が容易になります。 このときクロロホルムは沈殿に包まれるようにになって、 >一部、膜で包まれたような液性の部分 のように見えなくもない。

プラスミド抽出の際のペレットについて 削除/引用 No.9112-1 - 2020/08/27 (木) 13:16:20 - あああ 形質導入した大腸菌からプラスミド抽出する際のペレットについて質問です。アルカリ化→中和するとゲノムDNAとか変性したタンパク質のペレットができると思いますが、一部、膜で包まれたような液性の部分ができます。 あの膜の中の液体は、上清と同じプラスミドを含む成分なのでしょうか？そうであればプラスミドの収量を上げたいので、しっかり遠心するなりして、回収したいと思います。それとも夾雑物を含む成分なのでしょうか。 ご教示お願いします。

全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---