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異なる細胞数の培養上清のELISAの補正方法 トピック削除
No.9098-TOPIC - 2020/08/23 (日) 10:02:48 - SALI
いつも勉強させていただいています。

私は2種のマウスから単離した接着細胞を培養したく、その後にその培養上清に含まれるサイトカインの量を比較することを目標にしています。

その細胞は肝臓を酵素処理して得られたものからソーティングにより分取します。

ただ、分取する前の総細胞数、ソーティングで得られた細胞数、それをプレートに播種した際の細胞数や死滅数を加味し接着する生細胞数を厳密に2種間のマウスで揃えることは実際問題不可能です。

ELISAで培養上清を対象するため、細胞数が異なるのは致命的になりますので、どうにか細胞数を揃えるというよりかは、異なる細胞数からELISAを行う際に補正ができないか考えています。

皆様はどのようにされていますでしょうか？


思い浮かんだのは、培養上清を除いて、更に洗浄した残りの接着細胞を界面活性剤で溶解し、乳酸脱水素酵素などの細胞質酵素活性を測定することで補正できないか考えています。ただ、この方法が一般的なのかがわかりません。そのライセートの濃度を測定するのも手だとは思いますが、おそらくタンパク質濃度はそれほど高くないと思うので難しそうです。

コメントをいただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.9098-5 - 2020/08/25 (火) 05:56:23 - M
残った全細胞から抽出したタンパクを定量して、その総タンパク量で上清のELISAを補正してます。細胞内タンパク量が細胞量を反映するという考えです。手法も簡便ですし、24-wellくらいまでならバッファー量を調整すれば問題なく測れると思います。96-wellだとちょっと厳しいかもしれませんが、細胞数次第ですね。サイトカイン測定ですから、ソートするのはkupffer細胞とかでしょうか？数が取れない場合はちょっと難しいかもしれませんね。

サイトカインの発現量自体には２種のマウスで差がない事が分かっていれば、そのサイトカインの細胞内外での量を全部ELISAで定量して、細胞内外の比で表す形でも、分泌効率の差をみる事ができるように思います。発現量に差がある場合は、分泌タンパク量ではなくRNA定量や細胞内FACSの方が、特に数が取れない細胞の場合はやりやすいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.9098-4 - 2020/08/25 (火) 01:41:36 - 森
>[Re:1] SALIさんは書きました :

> 思い浮かんだのは、培養上清を除いて、更に洗浄した残りの接着細胞を界面活性剤で溶解し、乳酸脱水素酵素などの細胞質酵素活性を測定することで補正できないか考えています。ただ、この方法が一般的なのかがわかりません。

卒論か修士論文のテーマでしょうか？先生や先輩にも相談して、あなたが考えて妥当だと思った方法でやればいいです。

(無題) 削除/引用
No.9098-3 - 2020/08/24 (月) 02:15:24 - おお
>[Re:1] SALIさんは書きました :


> 思い浮かんだのは、培養上清を除いて、更に洗浄した残りの接着細胞を界面活性剤で溶解し、乳酸脱水素酵素などの細胞質酵素活性を測定することで補正できないか考えています。

MTTやWSTなどで細胞数のEstimationをすることはあり得るので、ほぼ同様の方法論かと思います。あまり手の混んだことはしなくていいので、培地をMTTあるいはWSTを含む培地に置換してやればいいです。ただし違う日にやった結果をどの程度比較できるかはわかりません。

一番いいのはちゃんとCell countするです。今は画像を取得して数えてくれるものもあるので使えるならやりやすいかと。
蛍光色素をつかってDNA量で換算することも可能でこれならスタンダードを起きやすいので違う日の比較もやりやすいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.9098-2 - 2020/08/23 (日) 14:22:47 - あああ
気持ちはわかりますが、n数を稼いで細胞数の平均値は一緒と考えれば良いのではないでしょうか？

異なる細胞数の培養上清のELISAの補正方法 削除/引用
No.9098-1 - 2020/08/23 (日) 10:02:48 - SALI
いつも勉強させていただいています。

私は2種のマウスから単離した接着細胞を培養したく、その後にその培養上清に含まれるサイトカインの量を比較することを目標にしています。

その細胞は肝臓を酵素処理して得られたものからソーティングにより分取します。

ただ、分取する前の総細胞数、ソーティングで得られた細胞数、それをプレートに播種した際の細胞数や死滅数を加味し接着する生細胞数を厳密に2種間のマウスで揃えることは実際問題不可能です。

ELISAで培養上清を対象するため、細胞数が異なるのは致命的になりますので、どうにか細胞数を揃えるというよりかは、異なる細胞数からELISAを行う際に補正ができないか考えています。

皆様はどのようにされていますでしょうか？


思い浮かんだのは、培養上清を除いて、更に洗浄した残りの接着細胞を界面活性剤で溶解し、乳酸脱水素酵素などの細胞質酵素活性を測定することで補正できないか考えています。ただ、この方法が一般的なのかがわかりません。そのライセートの濃度を測定するのも手だとは思いますが、おそらくタンパク質濃度はそれほど高くないと思うので難しそうです。

コメントをいただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。
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