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(無題) 削除/引用 No.9097-7 - 2020/08/24 (月) 16:05:08 - Tany すみません、おそらく原因が判明しました。 今回使用したライブラリー調整キットはsecond strand cDNA合成の際にdUTPを取り込ませ、後にUSER enzymeで消化することでstrans specificにしています。そのようなライブラリーの場合、アンチセンス鎖がfirst readとして読まれるようなのですが，de novoアセンブリの際にそこの設定が間違っていました。 おそらく遺伝子配列が逆転していたのはそのためだと思います。 皆様のご指摘のおかげで気付くことが出来ました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9097-6 - 2020/08/24 (月) 14:59:08 - Tany Salmonの機能を使ってライブラリータイプを検出してみると，『Automatically detected most likely library type as IU』となりました。IU = an unstranded paired-end library where the reads face each otherとのことなので、なぜかstranded-specificではないと検出されてしまいました。 うむむ、なぜなのでしょう・・・。 ちょっとデータ解析の頭から振り返って確認してみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9097-5 - 2020/08/24 (月) 10:46:19 - seventh 別のツールのものですが、出力transcriptが5'-3'方向で出力されているか確認してみてください。 https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Examine-Strand-Specificity strand specificなアセンブルでも逆向きに見えるcontgは結構でます。ミスアセンブルなのか実際に逆鎖が発現しているのかは追加で個別解析しないと特定できないと思います。

(無題) 削除/引用 No.9097-4 - 2020/08/24 (月) 10:38:34 - G25 overlapping genesというものがあり、逆向きの遺伝子がオーバーラップしているとそうなります。そういうのはUTRの場合がほとんどですが、Tanyさんのケースはいかがでしょうか。 それと、crypticな逆向きの転写産物はしばしばあって、ときに二本鎖RNAを生じてRNAiを起こしたりします。内在的にもあったと思いますし、トランスポゾンやプロウイルスのプロモーターからの転写や、遺伝子導入によって生じるco-suppressionなどではよくありがち。

(無題) 削除/引用 No.9097-3 - 2020/08/24 (月) 09:45:57 - Tany おお様 コメントいただきありがとうございます． ゲノム配列を見た場合に逆の鎖にもTranscriptsが見つかることは存じております．今回はRNA-seqということで、Transcriptsに由来するリードから推定の遺伝子配列を再構築しています．その場合にはORFが順方向のコンティグのみが得られるはずなのではないかというのが私の質問でした．言葉足らずで申し訳ありません．

(無題) 削除/引用 No.9097-2 - 2020/08/23 (日) 00:58:18 - おお https://uswest.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?db=core;g=ENSG00000003756;r=3:50088919-50119021 方法論によるのでしょうけど（詳細は私も調べないとコメントできませんが）、モデル生物やヒトでも反対の鎖にもTranscriptsが見つかることがあります。そのへんは考慮に入れてますでしょうか。 スタンダードと言われますが、具体性がないので方法論を知った上での質問なのか不明瞭ではあります。

strandedなRNA-seq解析でORFが逆向き 削除/引用 No.9097-1 - 2020/08/22 (土) 15:44:10 - Tany いつも参考にさせていただいております． RNA-seq解析において気になることが出てきましたので質問させてください． 今回ある非モデル生物を用いて，次世代シークエンシング⇒de novoアセンブリ⇒DEGの検出というごく一般的な解析を行っています． ここで得られたDEGについて解析を進めているのですが，いくつかのコンティグについて遺伝子のORFが逆向きに入っているものがありました． 今回RNA-seq用ライブラリーの調整には，Strandedな解析が可能なNEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illuminaというキットを使用しています．またde novoアセンブリにはTransLiGを使用し，Strandedなリードの解析に適切なオプションをつけています． そこで質問なのですが，de novoアセンブリまでの過程でコンティグが逆相補鎖になることなどありうるのでしょうか？ライブラリー調整キットの説明にも「シーケンスリードは元の RNA の方向性を保っている」との記載があるのですが・・・． 当方RNA-seq解析を初めて間もないですので，何か基本的な勘違いをしていたら申し訳ないのですが，どうぞよろしくお願いいたします．

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