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(無題) 削除/引用 No.9081-10 - 2020/08/25 (火) 01:30:37 - もも >[Re:1] ぶーさんは書きました : > 培養細胞の上清を1500rpm 4℃ で10分間遠心し(50ml tubeにて)、上清を回収し、 > その後ELIZAをしているのですが、後輩が実施するとあまり安定しません。 > 何かこつなどあるのでしょうか？ 後輩が実施するとあまり安定しない、ということはあなたがやれば安定するのですか？だったら後輩の横について一緒にやって、あなたのコツを教えてあげてください。

(無題) 削除/引用 No.9081-9 - 2020/08/20 (木) 15:08:58 - cfg マイクロピペタの数字を桁間違えることはあるかもしれないですね。かなり慣れてる人でも、普段使ってるのと違うメーカーのとか使うと、アレッーーーか、ヤバ　みたいになることありますしね。なので新しい人だともっと間違えやすいのは当然ですね。自分が新人の頃を思い出して間違いやすいところ予想してあらかじめリストアップして、ここ間違いやすいので気をつけてと前もって言ってあげるだけでも偶発的あるいはテクニカルなミスはかなり減らせると思います。 後輩とかに教えるときは 1. 実験マニュアルを作成して渡す。 2. 一緒に実験して、１回は通しで説明しながら実演して見せる。（試薬調製も含めて） 3. 一緒に実験して、自分でやってもらうのを横で見ながら必要に応じて指導。（試薬調製も含めて） 4. 一人で実験してもらって、わからないところ、心配なところは随時聞いてもらう。（ここでハアとか、チッ、とか　ッたく、とかみたいな態度で接したら絶対ダメです。そういう人は2度と聞いて貰えなくなります。） の4段階でやってきました。大抵はこれでいけてます。

(無題) 削除/引用 No.9081-8 - 2020/08/19 (水) 13:12:49 - ぱち みなさん細胞にのみ問題があると考えていますが、ELISA操作が怪しい可能性はありませんか？ 原因を突き止めるためには、明らかなミスの心当たりがない場合は最初にある程度大まかにどこに問題がありそうか絞り込んだ方がいいと思います。 今回の実験では、細胞培養、回収、ELISAの3つに分けて考えてみたらいかがでしょうか。 後輩が回収した細胞上清が残っているならば、始めに質問者さんが後輩が回収した細胞上清を用いてELISAを行ってみて、それでもばらつくようなら細胞培養に問題と考えます。経験上、上清の回収の段階ではあまり問題にならないかと。 後輩指導をしていると自分では思いもよらないような、常識的に考えておかしいこともその子にとっては非常識のこともあるので1から見て指導するのが結局手っ取り早いです。 院生でもピペットマン操作が怪しい、単位を間違え、サンプルを常温で保存して分解していたなども割と多いです・・・。 培養スケールが毎度異なるとのことですが、それ以外も全て同じ条件にして質問者さんと後輩の結果を比較しないと解決まで長引くので、統一したほうがいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.9081-7 - 2020/08/19 (水) 11:17:13 - zwぇcrtvbyぬ 細胞が産生する成分を測定してるならば。培地を交換してからconditioned mediumを回収するまでの時間や細胞数で大きく異なると思う。（作る側の数と貯まるまでの時間が違えば、結果も変わってくる。）うちらが最近やってる実験では、大体コンフレントになった時点で培地を交換（無血清培地）して培地量もいつも一定にしてそこから24時間培養してconditioned medium回収してます。初代培養だとPDLsに依存して性質変わってくるから（ああいうのは継代の初めの方と後の方では基本的に別の細胞種とおもった方がいい）そこらへんも合わせる必要があると思う。 なので培地回収以降よりも、それ以前の初めの細かい実験条件の設定がふわふわしてるような気がするのでそこらをよく確認してあげて、あなたの条件を細部まできちんと伝えて、そこらをガチで決めてやれば安定すると思う。。

(無題) 削除/引用 No.9081-6 - 2020/08/18 (火) 23:39:00 - おお >[Re:3] ぶーさんは書きました : > ありがとうございます。 > 同じ群でwell同志を混ぜて1つの溶液として遠視分離するのも問題ないでしょうか？ それって解決方法になっているでしょうか？テクニカルな落ち度でばらついているのをごまかしているだけという見方はできませんか？ 同じWellから複数回測ってばらつきますか？細胞のコンディションはどうですか？ >[Re:4] 111さんは書きました : > >>同じ群でwell同志を混ぜて1つの溶液として遠視分離するのも問題ないでしょうか？ > > 混ぜる数などを各群でそろえてあれば問題ないかと思います。 > > ただ、その後統計処理をするとなると、混ぜた段階でそれはN=1となってしまうので、Nを増やすためには、別の日に培養した細胞、別の凍結tubeから取り出した細胞、継代数が異なる細胞などというようにしていると、それぞれ別の誤差が生じるような気もします。 > 複数のWellからとって平均するのと、混ぜて測るのは統計的には同じことです。 エラーバーがつかないと言いますが、それはテクニカルTriplicate等という話でそもそも実験を複数回して得られるエラーバーとは違います。 前者は一回しかしてないから再現性を取れという話です（極稀に例外もあるでしょうけど）。 継代数などで変わるというのは最初にある程度チェックしとけば許容範囲がわかるでしょうから雰囲気で実験するのは科学的にどうかと思うけどどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9081-5 - 2020/08/18 (火) 23:11:11 - ぶー 本当にご親切にありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.9081-4 - 2020/08/18 (火) 15:23:41 - 111 >>同じ群でwell同志を混ぜて1つの溶液として遠視分離するのも問題ないでしょうか？ 混ぜる数などを各群でそろえてあれば問題ないかと思います。 ただ、その後統計処理をするとなると、混ぜた段階でそれはN=1となってしまうので、Nを増やすためには、別の日に培養した細胞、別の凍結tubeから取り出した細胞、継代数が異なる細胞などというようにしていると、それぞれ別の誤差が生じるような気もします。 cell lineであれば比較的安定とは思いますが、24時間培養というプロトコルのつもりでもスケジュールによって25時間になってしまった、というときでも意外な誤差がでることもありますので。 4群を6 well ×4 plateで培養し、同群2 wellずつ混合して上清を得た場合はN=3ですのでcell lineでしたら統計学的有意差は出るかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9081-3 - 2020/08/18 (火) 12:56:37 - ぶー ありがとうございます。 10cm, 6well, 12wellとその度変わりますが、共通して50ml tubeを使用していました。 1.5-15mlでやるように指示してみます。 wellごとのばらつきは感じないのですが、ここのばらつきを確実に消すために、 同じ群でwell同志を混ぜて1つの溶液として遠視分離するのも問題ないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9081-2 - 2020/08/18 (火) 12:30:00 - 111 50ml tubeで遠心ということは150mm dishなどで培養したもの同士を比較しているのでしょうか？？ 50mlは遠心後にpelletが剥がれやすいので1.5/2.0mlあるいは15mlのほうが私は重宝しています。 継代ではなく、上清だけであるならば遠心速度はさらにあげてもいいかと思います。極端に言えば15000rpmとか。上清に混じった死細胞とかを確実に除去できます。 あとは、そもそもの培養細胞のwellごとのバラツキが原因な印象もありますが顕微鏡で見た際の細胞状況についてはいかがでしょうか。

培養細胞の上清採取のコツ 削除/引用 No.9081-1 - 2020/08/18 (火) 12:01:10 - ぶー 培養細胞の上清採取のコツってありますか？ 培養細胞の上清を1500rpm 4℃ で10分間遠心し(50ml tubeにて)、上清を回収し、 その後ELIZAをしているのですが、後輩が実施するとあまり安定しません。 何かこつなどあるのでしょうか？ 下にスレたてたのですが、タイトル修正のため再投稿です

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