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BioRad Trans-blot Turbo 削除/引用 No.9075-10 - 2020/08/18 (火) 11:37:21 - mont 最近、タンク式からBioRad Trans-blot Turboに移行しましたが、とても気に入っています。かなりお勧めです。mini-gel１枚なら３分、mini-gel２枚なら７分で転写できますが、特殊な転写バッファーとパッドを使う必要があります。普通のセミドライ用のバッファーでは、高速転写はできません（たぶん、３０分以上の通常プロトコールを選択することになります）。20人ぐらいのラボですが、Trans-blot Turbo 一台、カセット二つで問題ありません。 このバッファーとパッド、BioRadから買うと高いので、自作しています。私は転写が早いと言われるTGXゲルを使っていますが、ラボの同僚は普通のゲルでも３分または７分のターボプログラムを使って上手くいっています。使い方はBioRadのマニュアルに従ってください。 バッファー、パッドの種類、枚数、サイズは重要なので、変えないように。私はパッドは1回で使い捨てにしていますが、続けて数回使いまわしている同僚もいます。PVDFはBioRadのLF-PVDFまたはミリポアのイモビロンでも上手くいっています。 使い終わったカセットは、すぐにDWで洗うことを強くお勧めします。バッファーが付着した状態で放置すると、プラスチックの本体や電極部分が腐食して、ボロボロになってしまいます（隣のラボのカセットは一年経たずにボロボロになって要交換でした）。まずは最短プロトコールで試してみて、適宜タンパク質のサイズによって転写時間を微調整してください。 5X Transfer buffer (do not adjust pH) 1.5 M Tris 1.5 M Glycine 0.25% SDS 1X Transfer buffer (pH ~9, do not adjust pH) 300 mM Tris 300 mM Glycine 0.05% SDS 20% EtOH Stack pads 7 layers of “Amplitude EcoCloth” Cut into the size: mini=6.75x8.5 cm, midi=13.5x8.5 cm Amplitude EcoCloth https://www.fishersci.com/shop/products/contec-amplitude-ecocloth-cleanroom-wipers-1/19120823 ＊Prepare 1L of 1Xtransfer buffer by mixing 200 mL of 5X TransBlot Turbo transfer buffer with 600 mL of MilliQ water and 200 mL of ethanol. Store at 4C for 6 month.

(無題) 削除/引用 No.9075-9 - 2020/08/14 (金) 09:39:46 - semi 詳しい情報ありがとうございます。 湯気が出るって凄いですね！従来のTrans-blotではそんなシーンにお目にかかったことはありませんでしたが、Turboはそれだけ速いってことなんでしょうね。 カセットも、1つで問題ないという情報助かります。でもまぁ、セットで買えば多少お得っぽいし、ケチらなくてもいいのかな？って気もしてきましたが、しかし反応の速さ的に、なくても一切問題なさそうな気もするし、悩ましいですね。 Native gelの場合は・・・という話で一つ思い出したのですが、このブロッターに限らず、セミドライのブロッターをノーザンブロットに使うことは可能なんでしょうか？まぁ常識的に考えて、全く問題ない感じですかね。 あとマニュアルを見たら（https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10016505E.pdf）、presetのプロトコルとしてSTANDARDは30分になっているようですが、コメントお見受けする限り7分の方を使っていらっしゃるみたいなんですけど、別に両者に違いはない、って感じなんでしょうかね。30分でも十分速いですが、違いがないならやっぱり7分でとっとと終わらせたくはありますね。 たびたびの質問で恐縮ですが、お手すきの時にまたコメントいただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9075-8 - 2020/08/14 (金) 07:56:41 - まわし者じゃありません カセットは一つでも二つでも構いませんし、どちらか一つが使われている途中で、二つ目を始めても問題ありません。ただし、二つのカセットを違う条件で、同時に転写することはできないようです。最初に走っている条件に固定されます。 あと、セミドライはかなり温度が上がるので（湯気が出る）、未変性のサンプルを流した時（native-gel)は、タンクを使ってコールドルームで転写しています。

(無題) 削除/引用 No.9075-7 - 2020/08/14 (金) 04:04:04 - semi 追っての情報、改めてありがとうございます。 結局、asanさんのおっしゃる通り、好みの問題レベルの話ということになるのかなと思いますが、通常の使用ではセミドライで問題がないと思われること、また問題になりそうな場面に遭遇したら普通に今あるウェット型を使えばいいだけのことなので、今回はセミドライ型を購入しようかなと考えがまとまりつつあります。 いただいたコメントから、一気にTurboが欲しくなりましたが、既にBio-Radにコンタクトを取ってみたんですけど、そもそもmidiサイズの泳動装置がないものでそこから質問してみたところ、Bio-Rad現行のmidiサイズシステム・Criterionには、ガラス板が存在せず、基本的にプレキャストゲル推奨で、空のカセットも一応あるものの、それもプラスチックのディスポとのことで、ゲルをよく流す我々のラボではちょっとランニングコスト的に乗りづらいなぁ、と思っている状況です。 まぁそれはブロットとは関係ない独立した話なので、今回の質問とは関係ないんですけどね。 しかしTurboを見ていたら、ブロッターのカセットは2つ設置できるシステムのようなんですが、これをバラで1つだけ買うようにすれば、結構予算を節約できるようです。 https://www.bio-rad.com/en-us/product/trans-blot-turbo-transfer-system?ID=LGOQBW15 （写真下、Orderingタブ） そこでまわし者じゃありませんさん（あ、今更新したら、私も回し者ではありませんさんからも意見をいただけていました）に質問なんですけど、カセット1つでも実際の使用上は全く問題ない感じなのでしょうか？いやメーカーに聞けという話かもしれませんが、仕様うんぬんではなく、実際運用上での感想を、顧客側の視点から聞けたらなと思いまして。 まぁそれも「利用頻度による」としか言えないのかもしれませんが、ご意見いただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9075-6 - 2020/08/14 (金) 02:49:23 - 私も回し者ではありません >Bio-radのターボブロット。半信半疑で購入して、世界が変わりましたとまではいきませんが、ずーっと楽になりました。 私も全く同じ経験しました。泳動槽を洗い終わる頃には転写が終わってるって素晴らしい。 ただ、自分は150kDa程度の余り発現量の多く無いタンパクの転写をすることがあって、マニュアル的にはこれも10分の転写でいけるとあるけれど、これに関してはウェットでやった方が結果が良かった（2、3回比較の為の予備実験をしたことがあるが、同じ露光時間でウェットでやったメンブレンの方がかなり強いシグナルが得られた。マーカーの色はターボブロットの方が綺麗に残っているのに不思議。私の条件だと、タンパクはメンブレンに残っているけれど、マーカーの色は抜けていく？）経験を何度もしているので、100kDa以下のタンパクではターボブロット、150kDa以上ならウェット、その間の大きさは目的に応じて、と使い分けるようにしています。

(無題) 削除/引用 No.9075-5 - 2020/08/13 (木) 15:37:58 - asan まあ、好みの問題レベルの話だと思いますけどね。 セミドライはおっしゃる通りバッファーの量を極端に減らせる、時間短縮になるといったメリットが一番大きいかと思いますが、一方で極端に長時間のトランスファーは難しいとかで、実際高分子量の範囲のトランスファー効率が悪い場合があります。実際に目に見えてセミドライで行って問題があってウエットで問題がなかったとかまで比較した頃はありませんが、転写後のマーカーの残りとかでなら確認できるレベルでそうなることもあります。 最近はメーカーのうたってるセミドライ用の転写液とかもあるのでね。 個人的には普通の用途ではセミドライでいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9075-4 - 2020/08/13 (木) 11:30:38 - まわし者じゃありません Bio-radのターボブロット。半信半疑で購入して、世界が変わりましたとまではいきませんが、ずーっと楽になりました。ラボに一台ですが、10人くらいのラボで、十分足りてます。ミニゲルなら４枚、ミディのゲルで、２枚、約７分で転写が終わります。なので、もし、かち合っても待つのも気になりません。 お知らせまで。

(無題) 削除/引用 No.9075-3 - 2020/08/13 (木) 05:23:56 - semi emaさん、情報ありがとうございます。 なるほど、やっぱり特にセミドライシステムでも全然問題はないんですね。以前イマイチ安定しなかったのは、単に私の腕がヘボかっただけなのかもしれません。 シャープの全自動転写装置はこれですか… https://jp.sharp/sms/pdf/protein/bm-80/c_bm80_l1.pdf めちゃくちゃ面白いですね！シャープがバイオ系のビジネスをやってたという驚きとともに、二重の意味で面白いです。 ちょっと高いですが、デモぐらい試してみたくなりますね。 こういう最新のやつ含め、メーカーの方にもちょっと色々聞いてみようと思います。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9075-2 - 2020/08/12 (水) 16:03:21 - ema 今はBioRadのセミドライを使っていて、自分たちがみたい普通のKDaの蛋白については問題を感じていません。 持ってはいませんが、以前デモをしてもらったシャープのDIRECT　BLOTは面白いと思いました。

ウェスタンのセミドライブロット 削除/引用 No.9075-1 - 2020/08/12 (水) 04:54:29 - semi 新しいグラント（私じゃなくてボスが獲得したものですが）でequipmentの購入を考えているのですが、ウェスタンを結構やるのにブロッターが小さいもの1つ（Bio-Radの、赤黒のおなじみのやつです）しかないラボなので、まずは1つブロッターを買おうと思っています。 midiサイズのゲルも使えるものにしようかなと思っているのですが、大型になるとバッファーも結構使うし、もしかしたらセミドライの方がいいのかもしれないな、などと迷っている状況です。 以前所属していたラボでの経験上、セミドライはもちろん早くてバッファー使用量も極小でとても便利なんですけど、若干安定性に欠けた印象があります（そのため、個人的には専らウェットタイプ派です）。最近の、あるいはハイエンドモデルのものなら、安定性にも全く問題ない感じなのでしょうか…？ 使用経験のある方、好みやその他ご意見等、シェアいただけると大変ありがたく存じます。

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