Bio Technical フォーラム

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No.9075-27 - 2020/08/19 (水) 19:08:17 - TS
montさん

色々な情報ありがとうございます。参考になります。
とりあえず当方の自作のゲルで、montさんの転写バッファーを試してみようと思います。
ちなみに、このレシピはBio-radから販売されている転写キットと同じなのですか。レシピは公開されていたのでしょうか。

やはりTGXゲルは、キットを買わないと作れないのですね。。。
Stain-freeも検討してみます。

真琴さん

おっしゃるとおり電気泳動が速いゲルなら転写の時の移動も早くなりますよね。
スタッキングゲルなしで済むと、かなり楽になりますね。
グラジエントゲルの作り方の動画みました。すごいですね、これ。
コツもありそうですけど、慣れればうまくできそうな気がしました。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.9075-26 - 2020/08/19 (水) 11:03:53 - 真琴
TSさんのtransfer効率へのコメントですが、ゲルのbuffer組成も転写効率に大きく影響します。
つまり、泳動が早いbuffer recipeの方が転写スピードも早い。(transfer bufferでゲルを平衡化しないので)

私達は、自作のNuPAGE buffer (BisTris gel /MOPS or MES泳動buffer)を使って泳動しています。
https://openwetware.org/wiki/Sauer:bis-Tris_SDS-PAGE,_the_very_best
300 Vで15min程度で泳動が終わるので、古典的なTris Glysineより泳動速度が早い印象です。


ちなみに、最近はゲルを自作する場合は「全て」4-10%のNuPAGE グラジエントゲルにしてます。
スタッキングゲルもなし。Runningゲルのみなので、結果的にゲルを作る手間も短くてすみます。
簡易的なグラジエントゲルの作り方は以下。きれいにGradientを作れてます。
https://www.youtube.com/watch?v=zu5a-kpMK8k

目的の分子量によって泳動bufferをMOPS系かMES系に分けることで、全く同じゲルで高分子から低分子までを好きなようにカバーしてます。

なので、ゲルの泳動bufferを思い切って変えるのもありかもしれません。

StainFreeの自作法もあります 削除/引用
No.9075-25 - 2020/08/19 (水) 10:34:26 - mont
>[Re:22] TSさんは書きました :
> montさんの転写バッファーは1液ということでしょうか。両方の電極側も同じバッファーということですか。転写後のゲルにはタンパクがあまり残っていない感じでしょうか。

1液です、両方の電極側も同じバッファーです。BioRadのプロトコールと全く同じようにして使っていますので、BioRadのマニュアルをダウンロードしてお読みください。
最短のTurboプロトコールは、多分15から200kDaあたりに最適化されていると思いますので、高分子量のタンパクは結構ゲルに残っている印象です。目的のタンパクに合わせて微調整が必要なのは、どのプロトコールにも共通かと思います。後述のStain-Freeを使うと、ゲルにどのくらい残っているか、簡単に可視化できて便利です。すでに検出装置をお持ちなら、、、ということになりますが。

> それと自作のTGXゲルというのはどのように作られるのでしょうか。
> やはり通常のゲルに比べると、泳動時間が短縮できるのですか。

自作のTGX stain freeゲルは、BioRadの自作キットを使用しています。

https://www.bio-rad.com/en-ca/product/tgx-stain-free-fastcast-acrylamide-solutions?ID=MU5L50E8Z

少し高いですが、高いだけのメリットはあると思います。ゲルを作るのに30-40分、泳動が300Vで15分から20分ぐらいで完了します。転写効率もいいということですが、同僚は通常のゲルを使用して先述の方法でトランスファーして問題ないと言っていますので、それほど転写に関してはクリティカルではないのかもしれません。今のようにコロナで半日しかラボで働けないとなると、時間の節約が本当に助かります。

Stain-Freeは、クマシー染色に変わるタンパク質の定量方法のことで、BioRadのChemilumi検出装置でフィルターを変えるだけで簡単に検出できます。ゲルにもメンブランにも適用でき、検出感度はゲルならクマシー染色と同等かそれ以上、メンブレンならポンソー染色より感度はいいと思います。
アクチンなどのローディングコントロールの代わりに使用でき、総タンパク量の平均でノーマライズできるのを売りにしています。少なくともアクチンブロットをする手間が減ります。

で、このStain-Free、 2,2,2-Trichloroethanol (TCE) を普通のゲルに加えることで再現できますので、興味のある方は以下のリンクをお読みください。すでにStain-Freeをお使いのラボなら、BioRadの検出器をお持ちだと思いますので、少し実験の幅が広がります。
クマシー染色をするより断然早いです。

http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/method.pdf

長々と書き込んでしまいましたが、皆様のお役に立てば幸いです。

(無題) 削除/引用
No.9075-24 - 2020/08/19 (水) 09:52:42 - semi
montさん、面白い情報ありがとうございます。

このフォーラムは、「トピックを立てるときのみ(=No.XXXX-1のみ)、URLを掲載することができない」という謎仕様があるようなので、エラーが出るのはURLを含んでいたからと思われます。

また、スレ違いの話題を嫌う風潮も世の中の掲示板にはあるようですが、私は一切気にしない(というかむしろ脱線して情報が増える方が圧倒的にありがたい)ので、「トピ主の話題とはうんぬん…」は一切気にしていただく必要なしでございます、という業務連絡まででした。

お礼を言ったのにまだ読んですらいないので、montさんの追加情報をじっくり読ませていただこうと思います。

ウェスタンの高速ブロッキングレシピ 削除/引用
No.9075-23 - 2020/08/19 (水) 09:41:51 - mont
すみません、新しいトピックを立てようと思ったのですが、なぜか上手くいかないので、このスレに投稿させていただきます。後で何度も投稿されていたら申し訳ないです。

ウェスタンの高速ブロッキングについてもう一つ情報をシェアします。
ネットで見つけた方法なのですが、あらびっくり、転写後のPVDFメンブレンを1分浸すだけでメンブレンのブロッキングが完了してしまいます。ブロッキング後TBSTまたはPBSTで数回軽くリンスして、一次抗体反応を続けます。「標準的なプロトコールの5%Skim milk・TBSTで室温1時間、洗浄30分」が必要ありません。最初に2%PVA溶液を作るのが少し面倒で、私は電子レンジとスターラーを何度も往復して、温度を測りながら1時間以上かけて作りました。でも一度作ってしまえば、かなり長く使えそうです。ストック溶液は遮光保存しています。ワーキング溶液はベンチ上に放置で週に数回使用、1ヶ月ぐらい経ちますが問題ありません。いつまで放置できるのかは謎です。以下に元記事へのリンクと少し修正したバージョンを記載しますので、試してみたい方はご自由に。
こんなに簡単でいいの?と不安になりますが、ちゃんとメンブレンへの抗体の吸着は抑えられます。私は目からウロコ落ちました。この方法を使い始めてまだ日が浅いので、この先何か問題(抗体によってはタンパクとの結合を阻害するとか)が出てくるかもしれませんが、その点はそれぞれご自分で解決してください。

私が使ったPVAはこちら。
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/363065?lang=en&region=CA

Based on
http://www.protocol-online.org/biology-forums-2/posts/11648.html

You can use PVA(polyvinyl alcohol) (size 140-180k).

The original article talks about 1 part per million for few seconds.
I usually prepare a 100ml container with higher concentrations which works better, and ad thimerosal 0.01% (it should be between from 0.001 to 0.01%) to avoid fungus grow. I change it from time to time.
To use it I usually live the membrane there 1 minute.

If you increase the concentration you will get even better non-background.

The original article uses a different molecular weight(maybe 50-100k) and they find that it works as a standard block, ie more block less background and less signal.
But in a patent about HRP preservation I read that the PVA of molecular weight 130-180 doesn't seem to interact with proteins, thus blocks membrane but not protein interaction.

I bought mine from sigma but it will certainly work from any other source, just make sure that the molecular weight is on that range.
I usually make a 2% stock, it is not easy to dissolve if you don't follow the instructions:
-Heat water to 60-70ºC
-Remove from heat and with agitation slowly pour the PVA dust.
-It may take some time to disolve, use agitation, and heat (never exceed 80ºC)
-Don't heat from the bottom with the PVA in as it may stick to that hot bottom.
-Heat will readily help it to dissolve, you can for example microwave for time to time.
-When it is disolved, add thimerosal 0,05% to avoid fungal grow.

10 parts per million is what I use (100ml water 50ul of my 2%stock and 1ml of 1% stock of thimerosal)
As much as 1% can be used.

(無題) 削除/引用
No.9075-22 - 2020/08/19 (水) 09:05:50 - TS
いつも勉強させていただいております。横からですみません。
montさんの情報が大変興味深く参考になります。
もう少し教えていただいてもよろしいでしょうか。

わたしもTurbo blotを使っています。
再現よく転写される印象ですが、わたしたちの方法だと転写効率がいまいちで、
転写後にゲルをCBBで染めると、結構残っています。
ただサンプル間のばらつきはとても小さく(同じサンプルを流したとき)、
解析に大きな問題は出ないのですが、転写効率を上げられたらといつも思っています。

私のところでは、以下の3液タイプの転写バッファーと一般的な自作ゲルを使っています。
Buffer Anode I (0.3 M Tris, pH10.4, 20% Methanol)
Buffer Anode II (25 mM Tris, pH10.4, 20% Methanol)
Buffer Cathode (25 mM Tris, pH 7.6, 40 mM 6-aminohexanoic Acid, 0.1% SDS, 20% Methanol)

montさんの転写バッファーは1液ということでしょうか。両方の電極側も同じバッファーということですか。転写後のゲルにはタンパクがあまり残っていない感じでしょうか。

> 1X Transfer buffer (pH ~9, do not adjust pH)
> 300 mM Tris
> 300 mM Glycine
> 0.05% SDS
> 20% EtOH

それと自作のTGXゲルというのはどのように作られるのでしょうか。
やはり通常のゲルに比べると、泳動時間が短縮できるのですか。

>厚さ1mm の自作mini-TGX stain-Free gel

色々横からで恐縮ですが、ご教授いただけると大変助かります。

(無題) 削除/引用
No.9075-21 - 2020/08/19 (水) 08:37:04 - み
montさん、真琴さん

EtOH 転写効率の情報ありがとうございました。
そしてトピ主の主旨から脱線して済みませんでした。

キットと比べるとそっくりです 削除/引用
No.9075-20 - 2020/08/19 (水) 07:24:12 - mont
見た目は、キットに含まれるパッドとAmplitude EcoClothはそっくりですよ。おそらく同じものだと思います。7枚使うのも、キットの真似です。私は繊維の方向が縦長になるようにカットしています、その方がローラーで泡を押し出しやすい気がするので。7枚まとめてカット、間にポストイットを挟んで、タッパーに入れています。ワンパックでかなり大量にパッドが作れるので、1回あたりにすると高くても1ドルとかぐらいじゃないでしょうか。日本から購入する方法、または同じ素材の代替パッドをご存知の方がいたら良いのですが。

私はやったことがありませんが、パッドを使い回すのは、続けて転写する場合です。1回目の転写が終わってメンブレンとゲルを取り除いた後、同じパッドに新しいゲルとメンブレンをセットして転写する同僚がいます。バッファーが足りなさそうなら継ぎ足すぐらいで。パッドを洗って乾かして使い回すわけではありません。なんかパッドに吸われたタンパクまで転写しそうだし、私はあまりお勧めしません。そこまでケチらなくてもいいかな。

カセットは、使用後にDWでよく洗うよう、しつこく皆に周知しています。またバッファーで外側が濡れた状態のカセットを本体に入れないこと、電極部分に結晶がないか使う前にチェックするよう教えています。乾かす時に立てかけるせいか、内側の電極部分(?)に結晶がたまることがあります。おそらくこの結晶に気がつかないまま使い続けると劣化しやすいのだと思います。ま、いい加減な人はどこのラボにもいるので、気がついたらラボミーティングで注意喚起です。

では、 Happy Transfer!!!

(無題) 削除/引用
No.9075-19 - 2020/08/19 (水) 04:47:13 - semi
めちゃくちゃ有益な情報、どうもありがとうございます!

パッドについても質問しようと思ってたんですが、完璧な情報をいただけて助かります。幸いこちら米国のため、Amplitude EcoClothを真似させていただこうと思います。


なお、ちょうど昨日購入に踏み切ったのですが(結局安くなってたこともあり、セット一式の購入にしました)、Bio-Radの担当者がたまたまこちらに来る用事があったとのことで、ちょうどパッドについても聞いてみたところ、「ワイパーを使うというのは全く聞いたことがない。元々TBTが産まれた当時は、高価なプレウェットパックを使っていたのだが、後にReady to Assemble (RTA) キットを開発した。これは元々のパックより、遥かに経済的である。今回のブロッター一式購入にあたりRTAキットも無料で同梱しているので、ぜひ試してみてくれ」という回答を(後ほどメールで)もらいました。

営業としては満点の回答ですが、まぁ無視して、EcoClothの方を試そうかなと思います(もちろんある内はキットを使おうと思いますが)。

再利用する方もいらっしゃるとのことですが、洗うんですかね…?EcoClothがどんなものかのイメージが全くないので洗浄に耐えうるものなのかどうかすら分からないのですが、EcoCloth自体もそれなりに値段がするもののようなので(もちろん公式のものより大分安いとは思いますが)、試してみようと思います。

元々、今使ってるWhatmanの3MMペーパー重ね置きでやろうかななどと思っていたのですが、かなり特殊でセンシティブなマシンのようなので、紙の重ね置きは流石にやめておいた方がよさそうですね。


とにかく、貴重な情報のシェア誠にありがとうございました。私は速やかに丁寧に洗う人なので問題ないと思いますが、ラボに洗わない人がいたらちょっと問題になりそうな気はしますね。必ずしも全員がきちんとはしていないのが研究室の世界共通事項だと思いますが、洗いの意識徹底も心がけるようにしようと思います。

繰り返しですが情報本当にありがとうございました。大変役に立ちました。

(無題) 削除/引用
No.9075-18 - 2020/08/19 (水) 01:21:11 - おお
BioRadで話が出ているのでまあ持ち出す必要があるかわかりませんが、電極が炭素のものと金属(片方がプラチナとか酸化などに耐性があるもの)があります。炭素の方は多分安価だと思いますが、寿命的には短いです。といっても使用頻度によるけど3年ぐらいは大丈夫かなという感覚ですけど。この辺はいろいろ経験のある人の話を書き込んでくれれば像がつかめてくるかなと期待している次第です。

(無題) 削除/引用
No.9075-17 - 2020/08/18 (火) 23:06:19 - 真琴
ちなみに、TransBlot (ethanol含有buffer)で15kDa以下のWBもうまくいっています。

それと、TransBlotのカセットについての情報ですが、使用している過程でカセットにヒビが入ることが何度かありました。Transferの時間を長くすると高温になること、あるいはBufferが拭き取れていなくて漏電?のせいで、割れてしまったのかと思っています。

ここからがポイントですが、カセットが割れてしまったことをBio-Radに相談したところ、無料で新品のカセットをくれました。

そういう意味でも、TransBlotお勧めです。

ちなみに、ゲルはプレキャストゲルじゃなくて、自作してます。

EcoCloth代替パッド 削除/引用
No.9075-16 - 2020/08/18 (火) 23:00:04 - 真琴
私もBio-Rad Transblotを日頃から使っています。

オリジナルのトピ題材とは少しずれますが、montさんの情報、大変参考になります。
EcoClothをパッドとして使用してるのは、目からウロコでした。検索するとBio-Radのパテントにも記載されてますね。なんとかパッドを自作したいと思っていたのですが、素材がわからなかったので、、。

EcoClothはアメリカで販売されているようですが、日本では検索しても出てこないですね。
どなたかEcoClothに対応するパッドをご存知の方いらっしゃらないでしょうか?
それとも、日本でも入手できますか?

MeOHとの比較はできませんが 削除/引用
No.9075-15 - 2020/08/18 (火) 22:45:52 - mont
>[Re:14]
> 高分子量域の転写効率や低分子量タンパクの保持などMeOHと比べて使用感教えてほしい。
> もちろん同じ転写装置使用しての比較で。

この装置でMeOHは使ったことがないので、比較できません。が、先述のEtOHを使ったレシピ、厚さ1mm の自作mini-TGX stain-Free gel(7.5〜12%)1枚、BioRadのLF-PVDF、Amplitude EcoCloth7枚重ねでサンドイッチ、2.5 A constant; up to 25 Vで3分、この条件で、15〜200KDaのタンパクの転写について問題に思ったことはありません。200KDa以上のタンパクの転写については、もう少し転写時間を長くした方が良いかもしれません。3分だと、高分子量のマーカーが、うっすらゲルに残っているので。15KDa以下はやったことがありません。サンプルを段階希釈すればもっと正確に比較できるのでしょうが、一年程使って実質的に問題無いのであえてMeOHを使う気にはなりません。何か問題があった時の選択肢の一つとして心に留めておく、と言った感じでしょうか。同僚は「6%、0.75mmか1mmの普通のゲル」でも問題なかったと言っています。
転写直後は確かに湯気が出るほど熱くなります。

ちなみにBioRadのプロトコールに従い、転写バッファーによるゲルの平衡化は行っていません。

また、ちょっとしたことですが、ゲルをガラス板からPVDF/パッド上に移動させる際に、ゲルより少し大きめに切り取った透明なクリアファイルをゲルに貼り付けてひっくり返し、一度クリアファイル上にゲルを移動させてから操作すると、ゲルを破壊することなく簡単に移動できるのでお勧めです。クリアファイルを2枚用意すれば、裏表の変更も簡単にできます。

(無題) 削除/引用
No.9075-14 - 2020/08/18 (火) 15:45:35 - み
>[Re:13] G25さんは書きました :
> MeOHは毒劇物なので、それでなければ格段に結果が劣るって場合じゃなければEtOHなどに置き換えられていく流れになっていますね。
> ゲル固定・CBB染色なんかもそう、めMethacarn (methanol-Carnoy)もEthanolを用いたオリジナルのCarnoyに回帰している印象。

>[Re:12] montさんは書きました :
> ホンマにEthanolです。BioRadのプロトコールもEthanolです。


知らんかったわ、勉強になったありがとう。
結果が劣る可能性があるのかい?
高分子量域の転写効率や低分子量タンパクの保持などMeOHと比べて使用感教えてほしい。
もちろん同じ転写装置使用しての比較で。

(無題) 削除/引用
No.9075-13 - 2020/08/18 (火) 15:30:38 - G25
MeOHは毒劇物なので、それでなければ格段に結果が劣るって場合じゃなければEtOHなどに置き換えられていく流れになっていますね。
ゲル固定・CBB染色なんかもそう、めMethacarn (methanol-Carnoy)もEthanolを用いたオリジナルのCarnoyに回帰している印象。

エタノールです 削除/引用
No.9075-12 - 2020/08/18 (火) 15:18:02 - mont
ホンマにEthanolです。BioRadのプロトコールもEthanolです。

(無題) 削除/引用
No.9075-11 - 2020/08/18 (火) 14:57:06 - み
>[Re:10] montさんは書きました :
>
> 5X Transfer buffer (do not adjust pH)
> 1.5 M Tris
> 1.5 M Glycine
> 0.25% SDS
>
> 1X Transfer buffer (pH ~9, do not adjust pH)
> 300 mM Tris
> 300 mM Glycine
> 0.05% SDS
> 20% EtOH


この機械の仕様しらんけどホンマにEtOHですか?
MeOHじゃなくて?

BioRad Trans-blot Turbo 削除/引用
No.9075-10 - 2020/08/18 (火) 11:37:21 - mont
最近、タンク式からBioRad Trans-blot Turboに移行しましたが、とても気に入っています。かなりお勧めです。mini-gel1枚なら3分、mini-gel2枚なら7分で転写できますが、特殊な転写バッファーとパッドを使う必要があります。普通のセミドライ用のバッファーでは、高速転写はできません(たぶん、30分以上の通常プロトコールを選択することになります)。20人ぐらいのラボですが、Trans-blot Turbo 一台、カセット二つで問題ありません。

このバッファーとパッド、BioRadから買うと高いので、自作しています。私は転写が早いと言われるTGXゲルを使っていますが、ラボの同僚は普通のゲルでも3分または7分のターボプログラムを使って上手くいっています。使い方はBioRadのマニュアルに従ってください。

バッファー、パッドの種類、枚数、サイズは重要なので、変えないように。私はパッドは1回で使い捨てにしていますが、続けて数回使いまわしている同僚もいます。PVDFはBioRadのLF-PVDFまたはミリポアのイモビロンでも上手くいっています。

使い終わったカセットは、すぐにDWで洗うことを強くお勧めします。バッファーが付着した状態で放置すると、プラスチックの本体や電極部分が腐食して、ボロボロになってしまいます(隣のラボのカセットは一年経たずにボロボロになって要交換でした)。まずは最短プロトコールで試してみて、適宜タンパク質のサイズによって転写時間を微調整してください。

5X Transfer buffer (do not adjust pH)
1.5 M Tris
1.5 M Glycine
0.25% SDS

1X Transfer buffer (pH ~9, do not adjust pH)
300 mM Tris
300 mM Glycine
0.05% SDS
20% EtOH

Stack pads
7 layers of “Amplitude EcoCloth”
Cut into the size: mini=6.75x8.5 cm, midi=13.5x8.5 cm

Amplitude EcoCloth
https://www.fishersci.com/shop/products/contec-amplitude-ecocloth-cleanroom-wipers-1/19120823

*Prepare 1L of 1Xtransfer buffer by mixing 200 mL of 5X TransBlot Turbo transfer buffer with 600 mL of MilliQ water and 200 mL of ethanol. Store at 4C for 6 month.

(無題) 削除/引用
No.9075-9 - 2020/08/14 (金) 09:39:46 - semi
詳しい情報ありがとうございます。

湯気が出るって凄いですね!従来のTrans-blotではそんなシーンにお目にかかったことはありませんでしたが、Turboはそれだけ速いってことなんでしょうね。

カセットも、1つで問題ないという情報助かります。でもまぁ、セットで買えば多少お得っぽいし、ケチらなくてもいいのかな?って気もしてきましたが、しかし反応の速さ的に、なくても一切問題なさそうな気もするし、悩ましいですね。

Native gelの場合は・・・という話で一つ思い出したのですが、このブロッターに限らず、セミドライのブロッターをノーザンブロットに使うことは可能なんでしょうか?まぁ常識的に考えて、全く問題ない感じですかね。

あとマニュアルを見たら(https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10016505E.pdf)、presetのプロトコルとしてSTANDARDは30分になっているようですが、コメントお見受けする限り7分の方を使っていらっしゃるみたいなんですけど、別に両者に違いはない、って感じなんでしょうかね。30分でも十分速いですが、違いがないならやっぱり7分でとっとと終わらせたくはありますね。

たびたびの質問で恐縮ですが、お手すきの時にまたコメントいただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用
No.9075-8 - 2020/08/14 (金) 07:56:41 - まわし者じゃありません
カセットは一つでも二つでも構いませんし、どちらか一つが使われている途中で、二つ目を始めても問題ありません。ただし、二つのカセットを違う条件で、同時に転写することはできないようです。最初に走っている条件に固定されます。

あと、セミドライはかなり温度が上がるので(湯気が出る)、未変性のサンプルを流した時(native-gel)は、タンクを使ってコールドルームで転写しています。

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