すみません、新しいトピックを立てようと思ったのですが、なぜか上手くいかないので、このスレに投稿させていただきます。後で何度も投稿されていたら申し訳ないです。
ウェスタンの高速ブロッキングについてもう一つ情報をシェアします。
ネットで見つけた方法なのですが、あらびっくり、転写後のPVDFメンブレンを１分浸すだけでメンブレンのブロッキングが完了してしまいます。ブロッキング後TBSTまたはPBSTで数回軽くリンスして、一次抗体反応を続けます。「標準的なプロトコールの5％Skim milk・TBSTで室温１時間、洗浄30分」が必要ありません。最初に2％PVA溶液を作るのが少し面倒で、私は電子レンジとスターラーを何度も往復して、温度を測りながら１時間以上かけて作りました。でも一度作ってしまえば、かなり長く使えそうです。ストック溶液は遮光保存しています。ワーキング溶液はベンチ上に放置で週に数回使用、1ヶ月ぐらい経ちますが問題ありません。いつまで放置できるのかは謎です。以下に元記事へのリンクと少し修正したバージョンを記載しますので、試してみたい方はご自由に。
こんなに簡単でいいの？と不安になりますが、ちゃんとメンブレンへの抗体の吸着は抑えられます。私は目からウロコ落ちました。この方法を使い始めてまだ日が浅いので、この先何か問題（抗体によってはタンパクとの結合を阻害するとか）が出てくるかもしれませんが、その点はそれぞれご自分で解決してください。
私が使ったPVAはこちら。
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/363065?lang=en®ion=CA
Based on
http://www.protocol-online.org/biology-forums-2/posts/11648.html
You can use PVA(polyvinyl alcohol) (size 140-180k).
The original article talks about 1 part per million for few seconds.
I usually prepare a 100ml container with higher concentrations which works better, and ad thimerosal 0.01% (it should be between from 0.001 to 0.01%) to avoid fungus grow. I change it from time to time.
To use it I usually live the membrane there 1 minute.
If you increase the concentration you will get even better non-background.
The original article uses a different molecular weight(maybe 50-100k) and they find that it works as a standard block, ie more block less background and less signal.
But in a patent about HRP preservation I read that the PVA of molecular weight 130-180 doesn't seem to interact with proteins, thus blocks membrane but not protein interaction.
I bought mine from sigma but it will certainly work from any other source, just make sure that the molecular weight is on that range.
I usually make a 2% stock, it is not easy to dissolve if you don't follow the instructions:
-Heat water to 60-70ºC
-Remove from heat and with agitation slowly pour the PVA dust.
-It may take some time to disolve, use agitation, and heat (never exceed 80ºC)
-Don't heat from the bottom with the PVA in as it may stick to that hot bottom.
-Heat will readily help it to dissolve, you can for example microwave for time to time.
-When it is disolved, add thimerosal 0,05% to avoid fungal grow.
10 parts per million is what I use (100ml water 50ul of my 2%stock and 1ml of 1% stock of thimerosal)
As much as 1% can be used. |
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