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自作グラジエントNuPAGE with 自作Stain Free 削除/引用 No.9075-52 - 2021/03/12 (金) 10:17:50 - mont かなり前のトピックになりますが、真琴さんに教えていただいた自作グラジエントNuPAGに自作Stain Free（2,2,2-Trichloroethanol (Final 0.5%)）を加えて試してみました。結果、BioRadのChemiDoc Imaging Systemで、TGX-Stain Freeと同等のシグナルが得られました。比較実験をしたわけでは無いのですが、Loading controlとして使う分には実用上問題なさそうです。いろいろ教えていただき、ありがとうございました。 ちなみに同僚は通常のSDS-PAGEでCBB染色の代用として使用しています。感度はCBBと同等で迅速なのですが、キムワイプ（？）の繊維などのゴミがStain Freeと同じ波長で検出されてしまうようで、特にOHPフィルムなどを使ってゲルを移動させる場合、静電気に気をつけないとバックグラウンドが汚くなってしまうようですので、ご注意ください。 自作グラジエントNuPAGでのCBB染色との比較はしておりませんが、いい感じな印象です。 あくまでも”やってみた”程度ですので、確立された方法ではありません。どこに落とし穴があるかわかりませんので、その点、ご了承ください。 遅くなりましたが、せっかくですので結果の報告まで。

(無題) 削除/引用 No.9075-51 - 2020/09/03 (木) 12:44:34 - TS semiさん 早速のご返答ありがとうございます。 そうなのですね。当方も普通のゲル（グラジエント）なので参考になります。 近いうち試してみたいと思います。 また何かわかればアップしてもらえると助かります。

(無題) 削除/引用 No.9075-50 - 2020/09/03 (木) 10:00:04 - semi 前回書いた後も思ったのですが、「煙」は言い過ぎでしたね。別にパッドやメンブレンが焦げたりするわけではないので。 転写後、オープンしたら「蒸気・湯気が立ち上る」、という方が適切でした（でも煙といえるぐらいに、結構ガッツリ出ます）、お詫びして訂正しておきます。

(無題) 削除/引用 No.9075-49 - 2020/09/03 (木) 09:51:30 - semi TSさん ゲルは、昔ながらの普通のゲルです（pH8.8の分離ゲルに、pH6.6のスタッキングゲルの例のやつ。Bio-Radの緑フレームでセットするミニゲルのあれで、ゲル厚1.0 mmです）。今回使ったのは15％ゲルで、もう何度もやっている実験系のため、ゲルの転写後染色はしませんでした、すみません（転写は初回なのでやるべきでしたね）。 15％とはいえ、低分子側中心の転写だったため、印象論でしかありませんが、ほぼ完全に移っているのではないかと思います（客観的・定量的ではない話で恐縮ですが）。最終シグナルは、15 kDaの目的産物で、これまで行ってきたウェットでの転写と完全に同一レベルでした。 転写バッファーは、装置の購入時にキットが無料でついてきたので、キット付属の純正5xバッファーです（EtOHは当然自前）。成分分析をしたわけでは当然ありませんが、montさんが以前お示しいただいたものと、恐らく完全に同一ではないかと思われます（これもめちゃくちゃ主観的ですが、水と混ぜた時の具合や泡立ち方が、いかにもmontさんのお示しのバッファーの通りでした）。 全然特別でもなんでもない組成のバッファーなので、ゲルも普通のもので全く問題なさそうなことから、ウェットタイプからの移行でのネックは、パッドのみかもしれませんね。 パッドに関しては、どんなものかと楽しみにしていたんですけど、(紙＋布)÷2みたいな、全然分厚さのない、ちょっと丈夫なキムワイプ、みたいな感じだったんですね（キムワイプよりは当然厚みがありますが）。今まで使っていた3MM paperの方がむしろ厚みを感じるぐらいですが、壊れても嫌なので（まぁ壊れないでしょうが）、ちょっとろ紙を重ねて試してみる気にはなれない感じですねぇ。 あ、でも、montさんがおっしゃっていたのを思い出しましたが、専用パッドを使わない場合は短縮プロトコルが使えないだけで、30分の標準プロトコルなら可能、という話だった気がしますし、ろ紙でもいけるという話でしたね、そういえば。 あんまり適当言うのもあれですが、多分ろ紙を重ねても、何だかんだ10分の転写とかでワークしそうな気がします。パッドも、全然そこまで特別なものには思えなかったので。 （まぁでもやっぱり、イオンスタックうんぬんという面において、このEcoClothが高電流下において絶妙な働きをしてくれているという可能性もなきにしもあらずなので、煙が上がるぐらいの高電環境ですし、下手なアレンジはしない方が吉かもしれませんね） 私個人的には、まだ1回使っただけですが、これは買ってよかった商品かな、と思います。自分の金じゃないからかもしれませんが(笑)

(無題) 削除/引用 No.9075-48 - 2020/09/03 (木) 09:03:51 - TS semiさん、情報大変参考になります。 現在の実験条件について少し整理させてください。 ゲルはTGXゲルではなく、普通の15％ゲルですか。 転写バッファーは添付のものではなく、montさんの組成でしょうか。 マーカーがきれいに転写されていたということでしたが、転写後のゲルの方は染色されたりしていますか（残っているタンパクがどれくらいか）。

(無題) 削除/引用 No.9075-47 - 2020/09/03 (木) 02:35:12 - semi 詳しく有益な情報、重ね重ねありがとうございます。 そういえば教えていただいたグラジエントゲルやブロッキング等はまだ試していないのですが、とりあえずconventionalなTris-Glycineゲル（下ゲル15％）で、前述の通り「パッドはキットのミニサイズの半分、ゲル＆メンブレンはさらにその半分未満の大きさ」で、全く問題なく今までどおり完璧に検出までできたことを報告しておきます。 しかし、montさんの情報によれば、むしろ3分の方がいい（かはともかく、それで十分）のかもしれませんね。色々検証していこうと思います。 バッファーは、やはり「律儀に2-3分たっぷりのトレー内で（しかもメンブレン・上パッド・下パッド全て別々のトレーで）完全に浸す」なんてことはしなくて良さそうですね。 しかしmontさん情報によると、この5xバッファーは実はただのTris/Glycine/SDSのようで、無意味にケチることもないだろう、というのが結論かもしれません。 あ、ちなみに、私はニトロセルロースを使っています。 メタノール浸潤が不要なのが超便利で、経験上、タンパク保持レベルに有意な違いが一切見受けられなかったため（少なくとも私の使っている系では。発現量も小さく、サイズも極小の扱いの難しいサンプルで並列比較までやったことありますが、むしろニトロセルロースの方が良好なシグナルだったまであるぐらい）ですが、ほぼどこのラボでも右向け右のようにPVDFを使ってる気がするんですけど、本当にPVDFの方が通常のウェスタンにおいて、有意に優れていると言えるんですかね…？ みんな名前のカッコ良さや印象論で、盲目的に比較検証もせずに使ってるだけじゃないの？…なんて思ってるのですが、今見たら私の使ってる0.2 umのニトロセルロースはPVDFとほとんど値段が一緒（単位面積あたりだと一応微妙に安いですが、ほとんど同じ価格）だったので、別にランニングコストも一緒ならあえて今まで使ってきたメンブレンを変える必要なんてない＝ニトロセルロースが低品質だった(?)時代の名残(適当ですが)で、もうPVDFがデファクトスタンダードとなっている、みたいな感じなのかもしれませんね。 とりあえず結論としては、Trans-Blot Turboは、評判どおり革命的に便利だった、という感じですね。 いただいたその他のお役立ち情報も、随時取り入れさせていただこうと思います。 色々と本当にどうもありがとうございました！また何かあったら、適宜アップデートさせていただくかもしれません。

バッファーの液量等 削除/引用 No.9075-46 - 2020/09/03 (木) 00:35:52 - mont 私のやり方です。 1.　パッド7枚をトレー（下）と、ひっくり返した蓋の部分の両方に置く。 2.　パッド全体が浸るまでバッファーを上からかける（私はビーカーから直接かけてます、量は目分量です）。ローラーで余分なバッファーと泡を押し出す。ローラーは軽く乗せ、コロコロしながらバッファーを均一に伸ばし、端から泡を押しだすようにする。端からバッファーがちょっとだけ染み出す程度の量、押し具合が適切に思います。バッファーは少し多すぎても、後で取り除けるので、少し多めの方が無難です。ただし蓋の部分に置いたパッドの方は、蓋の周りに漏れると厄介なのでビシャビシャにしないようにしています。 3.　パッドの上に、事前にメタノール処理後バーファーに浸したPVDFメンブレンを乗せる。ミニ2枚の時は、真ん中がゲルの上（高分子量）になるように置きます（BioRadの公式資料にそう載っていたので）。 4.　ローラーで軽くコロコロする（泡が入らないように）。 5.　ゲルより一回り大きなサイズに切ったクリアファイル（少し厚手のOHPシートのような素材が使いやすい）を用意し、泡が入らないようにガラス板状のゲルの上に乗せる。ガラス版をひっくり返して、クリアファイルの上にゲルを移す。 4.　PVDFメンブレンの上にゲルを載せる。ゲルはクリアファイルに貼り付いているので、クリアファイルをひっくり返して、ゲルの端からパッドの上に乗せます（泡が入らないように）。 5.　ローラーでコロコロしてメンブレンとゲルを密着させる。（ローラーの自重で軽くコロコロする程度。強く押すとゲルが変形してしまいます） 6.蓋の部分に置いた「バッファーを含んだパッド7枚」をゲルの上に端から泡を入れないように置く。 7.　ローラーでコロコロして全体を密着させる。 8.　トレーの蓋をする。 9.　トレーの蓋部分を手で押しながら（結構強く押しても大丈夫です）トレーを傾ると、トレーの端から余分なバッファーが流れ出てくるので、空いたタッパーなどに入れて捨てる。 10.　トレーの外側をペーパータオルで拭く。 11.　ゲルのサイズに合わせてプログラムを選ぶ。ミニ1枚なら3分、ミニ2枚なら7分のターボプロトコールが標準的ですが、お使いのゲルの組成、目的のタンパク質によって若干の調整が必要かもしれません。転写条件は、転写するサイズ（表面積）に依存するので注意してください。なので、ミニゲル1枚または2枚のパッドのサイズで適切な転写条件を見つけたら、パッドの大きさやゲルのサイズは毎回変えない方が無難です（PVDFメンブレンのサイズは変えてもいいと思いますが）。 パッドは、ミディサイズにはミディサイズのパッドを使ったほうがいいと思います（私ならミニ２枚は避けます、やったことないですが）。

(無題) 削除/引用 No.9075-45 - 2020/09/02 (水) 11:17:43 - まわし者じゃありません バッファーは、ピペットで全体が浸るぐらいプラスちょっとぐらいの量を使っています。下側の方は、カセット内で行なっています。 うちはキットしか使っていないのですが、ミディの場合は、キットのパッドを切らないでそのまま使っています。 一つだけ気づいたことですが、あまり転写液を使いすぎた上に、きちんと圧着をしてないと、転写が流れて起こることがあります。染色マーカーを使っているとマーカーが流れて転写されるのでわかります。 あと、膜の位置決めは一度で決めた方がいいです。動かした時、シグナルがダブって出たことがありました。 以上です。

(無題) 削除/引用 No.9075-44 - 2020/09/02 (水) 04:56:24 - semi 結局見切り発車で手探り状態ながらやってみたんですが、自己回答を述べてみますと… 1. キット付属のパッド（ミニゲル用、7.1 x 8.5 cm）を半分に切って、上と下7枚ずつを、1スタック7枚で賄う＆ゲルは、その半分の大きさのパッドの、更に半分どころかもっと小さい、5/15 ウェル・分離ゲルの下半分未満ぐらいのサイズで、7分のプリセットプロトコルを実施 →完璧でした。まだ検出まではしていませんが、マーカーは、むしろウェットの時よりしっかり移っている感じでした。ちなみに、転写が終わり、開けて上のパッドをオープンしたら本当にガッツリ煙が出てきて笑っちゃいましたね。 とりあえず、サイズが小さくても、気にせず標準短縮プロトコルで問題ないように思われます。 2. Run A/ Run Bを自分で選ぶ感じだったので、走らせない方は、セットしていようがいまいが全くどうでもいい感じでした。 3. バッファー50 mLを小さなトレイに用意して、パッドもメンブレンも3分ほど浸しましたが、十分浸ればそれで十分に思われるので、絶対50 mLも要らないじゃんと思ったのですが、どうでしょう？使用後、40 mLは余ってた気がしますね。再利用も気持ち悪かったので捨てちゃいましたが、全くもって無駄に感じました。 マニュアルでは、上下それぞれのパッドを、別のトレイに用意した50-70 mLに浸せ、とあるわけですが、どんだけ無駄遣いさせるんだ、バッファーをじゃんじゃん買わせたい企業の陰謀だろこれ、としか思えない感じですね。 皆さまどのぐらいのバッファーを使われているのか、情報シェアいただけるとありがたいです。 4. やってみたら、何気に、メンブレン→ゲルの順番でも全く問題ありませんでした。ウェットとは違って、水中でフワフワ浮いたりしないので、どっちでも問題ないのかもしれません。 あ、でも、今回はかなり硬いゲルだったのやりやすかった気もしますが、めちゃくちゃ柔らかいゲルだと、やっぱり、メンブレンの上に乗せるよりパッドの上に乗せる方が、ちょっと場所をミスった時に位置の調整がやりやすい気がするのでいいかな、って気もしますね。ただマニュアルには「一度置いたら場所を動かさないこと」ってあった気がするので、何に乗せる場合だろうと、根性で一発勝負のつもりでやるべきなのかもしれませんね。 5. ついでにやってて気になった点を1つ追加で質問したいのですが、装置購入で無料で付いてきたキットはミニサイズのものだったんですけど、ミディサイズのゲルをブロットしたいときは、ミニサイズのパッドを2枚並べて使うのでいいんですかね…？ やっぱり常識的に考えて、ギャップの部分が上手くいかなそうですし、ちゃんとしたサイズの1枚のパッドを使うべきでしょうか。 そもそもmontさんの場合は大きいサイズのEcoClothを利用されているようなので並べる必要などないように思いますが、もしミニパッドしかない状況でミディゲルをブロットしたい場合は、まぁTurboの使用は諦めてウェットでやって、とっととEcoClothを注文する、というのが常道になる感じですかね…？ 長くなりましたが、特に3番のバッファー使用量について、ご意見ありましたらお待ちしております。

(無題) 削除/引用 No.9075-43 - 2020/09/01 (火) 10:09:07 - semi ついに届いて使おうと思うのですが（実際はもう割と前に届いていて、単に使う機会がなかっただけなんですが）、想像よりずっと小型（パワーサプライより小さいですね）で、そもそもパワーサプライも必要ないのが素晴らしいですね。 使用前に微妙に気になることがあるので、またご助力いただけると助かります。 1. メンブレンの節約のためにも、よくゲルの必要な部分だけをカットしてそこだけトランスファーするのですが、ミニゲルとミディゲルで使用電流が違うように、ミニゲルを更にカットしたものは、例の7分の標準プロトコルより更に低電流あるいは短時間に変更すべきなのでしょうか？それぐらいケチらず、ミニゲルをまるっと使いましょう、という話なんですかね…？ 2. カセットを１つしか使わない場合でも、別に使わない方を外したりしなくても問題ないですよね？ 3. イマイチsoakの部分が分からないのですが、メンブレンもイオンスタックも別のトレーでバッファーに浸したら、そのままセットしてカセット内に追加でバッファーを注いだりする必要はないのでしょうか？マニュアルには50-70 mLに浸せとありますが、この数字も重要なんですかね…？ 4 ウェットのときは常に下からゲル→メンブレンとやっていたのでそれに慣れているのですが、このシステムは下からメンブレン→ゲルとなっています。どう考えても下ゲルの方が便利に思うのですが、ひっくり返してフタ側から置き始めて、最後セットしてまたひっくり返す、ってのはあまり上手い手ではないのでしょうか？ また使ってみたら疑問が出るかもしれませんが、さしあたり上記の点、経験者の方のご意見お待ちしております。

Amplitude EcoClothの製品情報 削除/引用 No.9075-42 - 2020/08/21 (金) 05:48:18 - mont Amplitude EcoClothの製品情報です。 https://www.contecinc.com/products/amplitude-ecocloth/ 私が注文しているのはAMEC004、30x30cmサイズです。 サイズが小さいので無駄が多くなるかもしれませんが、これは日本のサイトですね。 https://www.sekaimon.com/itemdetail/202476418930?country=US&title=Lot+of+1500+ct.+Contec+AMEC0003+Amplitude+EcoCloth+9%22x9%22+Wipers+Wipes%21 海外のサイトから直接輸入できませんか？送料が高くて割高になると思いますが。かさばりますが、重さは軽いです。私は北米在住ですが、送料を無視してコストを計算してみたら、mini-gel一枚を転写するのに、だいたい1回0.5ドルぐらいの計算になりました。

通常のセミドライにも使えるので 削除/引用 No.9075-39 - 2020/08/20 (木) 21:45:59 - mont >[Re:37] TSさんは書きました : > うちはAdvantecのろ紙（厚さ0.7mm)を使っています。ゲルとPVDFの上下に3枚づつです。 > > 私もWypallやAmplitude EcoClothが気になっていますが、バイオラッドのマニュアルには、ろ紙で大丈夫と書かれているようですよ。 > バッファーの浸し具合は重要と思いますが。 > > 日本で、WypallやAmplitude EcoClothっていうのは買えるんでしょうか。 あくまでも私の推測なのですが、通常のセミドライとしても使えるので、確かに「普通のろ紙も大丈夫」とマニュアルに書いてあるかもしれません。ただ、高速転写のプロトコールに「大丈夫」かどうかは？？？です。 キットのろ紙の枚数が7枚、という中途半端な数の特殊な素材なので「ああ、きっと何枚重ねが最適か、どの素材が安くて最適か、実験した人がいるんだろうな、それなりに理由があるんだろうな。。。」と思った次第であります。 バッファーの作成は簡単なので、どなたか試して結果をシェアしてくださるといいですね。Wypallはネットで検索すると、日本でも注文出来そうですが、物の割にはえらい値段が高くてびっくりしました。

(無題) 削除/引用 No.9075-38 - 2020/08/20 (木) 21:30:31 - vbghじ 通常の従来型のセミドライは、ウェトと同様にずっとふつうのやや厚手のろ紙を重ねてやってました。特に問題なくいい感じでデータ得られてました。CBB染色しても普通に転写されてました。高分子量（150KDa<)はどうしても不十分感ありましたが, 専用のペーパーでも同様なのでこれはろ紙のせいではないようでした。電極板が劣化してくるといろいろ問題起きてきました。

(無題) 削除/引用 No.9075-37 - 2020/08/20 (木) 15:04:02 - TS うちはAdvantecのろ紙（厚さ0.7mm)を使っています。ゲルとPVDFの上下に3枚づつです。 私もWypallやAmplitude EcoClothが気になっていますが、バイオラッドのマニュアルには、ろ紙で大丈夫と書かれているようですよ。 バッファーの浸し具合は重要と思いますが。 日本で、WypallやAmplitude EcoClothっていうのは買えるんでしょうか。

多分、ろ紙は代用できない？？ 削除/引用 No.9075-36 - 2020/08/20 (木) 12:50:20 - mont >[Re:33] みどりさんは書きました : > 横入りで申し訳ございません。 > > いま議論されているbio-radなどの転写装置で使用するろ紙やPVDF membraneはウェット式で使用しているものでも代用可能なのでしょうか？ > > bufferを作成し直すだけということであればかなり魅力的かなと感じています。 PVDFは同じもので大丈夫だと思いますが、ろ紙は代用できないんじゃないかな、と思います。多分なんですが「程よい量のバッファーを保持できる素材」を使うのがミソなのではないかと思っています。試したことはありませんが。 ネットではWypall X60を使ってる人もいるみたいです。 https://www.researchgate.net/post/Alternatives_to_Trans-Blot_Turbo_PVDF_packs 日本の代理店で買えるのかは知りません。 似たような素材のものなら、もしかしたら、、、、上手くいくかもしれません。

ありがとうございます。 削除/引用 No.9075-35 - 2020/08/20 (木) 12:27:20 - mont 真琴さん、回答ありがとうございます。 今日は頭の中で何度も「へええええ、そうなんだあ」を繰り返しています。 グラジエントゲルってスタッキング無いのですね、あまり使ったことがなかったので、恥ずかしながら知りませんでした。 なんかわかったようなわからないような説明ですが、スタッキングゲルがなくてもバンドがシャープになる理由を説明したサイトがあったので、 後学のために、ここにリンクを貼っておきます。 簡易グラジエント作成法もページの最後に紹介してありました。 こんな方法があるんですね、てっきりそれなりの装置がないと作れないのだと思っていました。 https://bitesizebio.com/47184/gradient-gels/ ちょっと調べたところ、shelf lifeも長くて４度で１年ぐらい保存できるみたいですね。コロナのお陰で在宅勤務時間が増えて、実験は捗りませんが調べ物が捗ります。

(無題) 削除/引用 No.9075-34 - 2020/08/20 (木) 12:03:53 - toto > スタッキングゲルが不要なのはどう理解すればいいのでしょう、今一つ理屈がわからず不思議です。 横から失礼します。スタッキングゲル、異なるpHを使う低濃度ゲルで濃縮する、という古典的な理論は都市伝説でしょう。この話、30年くらい前のMethod Enzymolのどこかに書いてありました。同じpHの低い濃度のゲルがあれば濃縮されるので、グラジエントゲルでは特に要りません。

(無題) 削除/引用 No.9075-33 - 2020/08/20 (木) 12:00:02 - みどり 横入りで申し訳ございません。 いま議論されているbio-radなどの転写装置で使用するろ紙やPVDF membraneはウェット式で使用しているものでも代用可能なのでしょうか？ bufferを作成し直すだけということであればかなり魅力的かなと感じています。

(無題) 削除/引用 No.9075-32 - 2020/08/20 (木) 10:48:28 - 真琴 montさん >Runningゲルのグラジエントを作って、ゲル板の最上部まで満たしてコームを挿し、polymerizeを待つという理解で合っていますか？ そうです。BioRadのミニゲルだと3ml (4%) + 3 ml (10%) = 計 6 ml をピペットで吸ってます。 動画では、ピペット内で泡を１回吸ってますが、私は2回すってます。 何度かトライするとコツが掴めると思います。コツは、ゲル板にアプライする時に、ピペットを左右に「すばやく」動かすことで、ゲル内の左右の濃度差が出ないようにすることです。ゆっくり左右に動かすと、左と右で泳動度が変わります。 何度かトライすればコツはつかめると思います。色々と工夫してみてください。 > polymirizeの時間はどのくらいでしょう？ APSとTEMEDの入れる量によるので、場合によりますが、こちらでは10-15分くらいですかね。 全てのゲルを4-10%で作っているので、一度に8枚のゲルを作製して、４℃で保存してます。(NuPAGEのpHが中性だから、可能となります）なので、８枚のゲルを作製する過程で、ゲルがチューブ内で固まってくると悲しいことになるので、念のため溶液は氷上で作製して、それを混ぜてアプライしてます。 > スタッキングゲルが不要なのはどう理解すればいいのでしょう、今一つ理屈がわからず不思議です。 これ、わたしもわからないです。市販のグラジエントもスタッキングなしですよね。 泳動してみればわかりますが、シャープなバンドがでますよ。

自作NuPAGEグラジエントゲルの作り方 削除/引用 No.9075-31 - 2020/08/20 (木) 10:22:08 - mont >[Re:26] 真琴さんは書きました : > 私達は、自作のNuPAGE buffer (BisTris gel /MOPS or MES泳動buffer)を使って泳動しています。 > https://openwetware.org/wiki/Sauer:bis-Tris_SDS-PAGE,_the_very_best > 300 Vで15min程度で泳動が終わるので、古典的なTris Glysineより泳動速度が早い印象です。 > ちなみに、最近はゲルを自作する場合は「全て」4-10%のNuPAGE グラジエントゲルにしてます。 > スタッキングゲルもなし。Runningゲルのみなので、結果的にゲルを作る手間も短くてすみます。 > 簡易的なグラジエントゲルの作り方は以下。きれいにGradientを作れてます。 > https://www.youtube.com/watch?v=zu5a-kpMK8k ビデオの要領で　Runningゲルのグラジエントを作って、ゲル板の最上部まで満たしてコームを挿し、polymerizeを待つという理解で合っていますか？polymirizeの時間はどのくらいでしょう？ スタッキングゲルが不要なのはどう理解すればいいのでしょう、今一つ理屈がわからず不思議です。 皆さん色々工夫されているのですね、勉強になります。

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