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(無題) 削除/引用 No.9037-19 - 2020/07/29 (水) 14:34:58 - AA ちょっと脇道にそれますが、ダイマーが生じた産物をカラムで精製してシークエンスに出すと、ちょうどダイマーぶんの長さがマルチピークになってまともに読めなくなります。 プライマーなどの一本鎖や、断端の極端に短い断片など以外は基本的にはカラムで取れてくると思ったほうがいいと思います。 クローニングの場合、バックボーンプラスミドのMCSのサイトを利用する場合など、それなりに長い断片が生じることもあると思いますので、丁寧にやるなら切り出したほうがいいのかなぁ、と思っています。 ゲル抽出でロスが出るから、とはじめのPCRをすごい量(数百ulなど)で始める人もいたりするので、ケースバイケースだとは思いますが・・・

(無題) 削除/引用 No.9037-18 - 2020/07/29 (水) 12:21:21 - G25 多少のプライマーダイマーがあってもそのまま行く、という選択があってもいいと思いますが、もし存在した場合、非常に良いライゲーションの基質となりますし（短いインサートのほうが効率がいい）、例えばゲル電気泳動のバンド強度で見た場合、同じ強度であれば短いほうが分子数は多いということを考えると、あなどれない。 ゲル切り出し精製をしてもなお、プライマーダイマー由来っぽいクローンが取れてきたりする。プライマーダイマーはハズレクローンのバックグラウンドを上げる要因となりうる。

(無題) 削除/引用 No.9037-17 - 2020/07/29 (水) 12:13:23 - G25 プライマーに設計したPCR産物末端の制限酵素消化で生じた末端の断片除去のための精製は、 多少、目的のライゲーション反応に干渉する（ベクターにライゲーションされて、目的の断片がライゲーションされる割合を下げる）かもしれないけれど、バックグラウンド（自己環状化や目的外のインサートをもつクローンの割合）を上げるわけではないので、それほど重要ではないと思う。 PCR産物精製の肝はやはりプライマーダイマーや非特異的産物の除去とポリメラーゼの除去。

(無題) 削除/引用 No.9037-16 - 2020/07/29 (水) 11:39:57 - 774 何かのキットの説明書で短い断片とか非常に長いDNAの回収率は低い。という表を見て、 断片除去のゲル精製は必要ないと思って省略するようにしました。 何となくですが、1本鎖のprimerや短い断片はカラムへの吸着が弱い・長すぎるとEluteされにくい。 あたりが原因かなと考えます。ご存知の方がいらっしゃれば教えてください。 ダイマーがでないよう条件検討したほうがいいと思いますが、 もしダイマーが出たとしてもPCR産物との比率次第では省略すると思います。 もちろん心配ならゲル精製したらいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9037-15 - 2020/07/29 (水) 10:02:45 - G25 >PCR産物の精製でプライマーが取り除かれるというのは以前から不思議に思っていたのですが、同様に短いDNA断片は回収できないということを利用した現象なのでしょうか？ カラム製品ごとの説明書に回収できるDNAサイズの範囲や、除去される短断片の上限の仕様が記載されているはず。 例えば、私の使っている製品では適用サイズ範囲が50 bp -10 kb、効果的に除去できるプライマー長が <25 bpとなっています。 プライマーモノマーならゲル精製しなくても除去が期待できいますが、 ダイマーやマルチマーが認められる場合は、ゲル切り出しをしたほうが無難。

(無題) 削除/引用 No.9037-14 - 2020/07/29 (水) 08:58:54 - おおお >[Re:13] 774さんは書きました : > PCR産物を制限酵素処理する場合、産物の端っこを切ることが多いと思います。 > 切れ端が数bpくらいだとカラムで回収しづらいので、 > ゲル精製は必要ないと考えて、最近はスキップしてます。 > 数十bpの断片がでるとかLigationの効率が悪いとかだと、キッチリやったほうがいいでしょうけども。 PCR産物の精製でプライマーが取り除かれるというのは以前から不思議に思っていたのですが、同様に短いDNA断片は回収できないということを利用した現象なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9037-13 - 2020/07/28 (火) 10:08:43 - 774 PCR産物を制限酵素処理する場合、産物の端っこを切ることが多いと思います。 切れ端が数bpくらいだとカラムで回収しづらいので、 ゲル精製は必要ないと考えて、最近はスキップしてます。 数十bpの断片がでるとかLigationの効率が悪いとかだと、キッチリやったほうがいいでしょうけども。

(無題) 削除/引用 No.9037-12 - 2020/07/27 (月) 17:57:00 - おおお ありがとうございます。ライゲーション後の精製は不要な実験系ですので、そこを省略してみます。

(無題) 削除/引用 No.9037-11 - 2020/07/27 (月) 17:55:29 - AA なんとなくカラム等を節約するようボスから言われたとかそういうことかと思っていましたがちょっと違ったのですね。 すでに皆さんご指摘の通りですが、ライゲーション後にゲル精製する必要はないと思います。 制限酵素処理後については、ゲル精製しないと断片の問題があるでしょうが、 ライゲーション後の切り出しではさて一体何が除去できるのか、考えるとわかると思います。 あと一般論的に、PCR産物の精製とゲル切り出しだとゲル切り出しの収率のほうが圧倒的に低いです。 試されればわかると思いますが、PCR後の精製を省いてもおそらく問題は解決しないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.9037-10 - 2020/07/27 (月) 17:47:48 - み >[Re:7] おおおさんは書きました : > ３．ライゲーション > （泳動・ゲル切出・精製） > とゲル切出・精製を繰り返すことになるので、そこをどうにか減らせないだろうかと考えました。 > やはり、無理はせず、素直に精製を行ったほうがいいようですね。 ライゲーション後、速攻トランスフォーメーションが普通だろう 制限酵素処理後は切れ端など余計な断片を除去しとかないとライゲーションこ時に競合するだろうから切り出し精製する。 PCR後の精製ほフェノクロエタ沈で終わりだろ。 結局、せいせいゲル泳動は1回しかやらん。

(無題) 削除/引用 No.9037-9 - 2020/07/27 (月) 17:27:31 - がぁが G25さんがおっしゃるとおり、PCR後に泳動・ゲル切り出しを行えば、ポリメラーゼは除去できます。制限酵素は加熱で失活できますし、制限酵素処理とライゲーションの後の泳動は必要ないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9037-8 - 2020/07/27 (月) 15:44:41 - G25 ライゲーションのあとのゲル切り出し精製が必須の実験なんですか？ 普通は必要ないし、効果的でもないのでしないけど。 別スレで、自己環状化モノマーを得たいと言ってた人かしら？ もしそうなら、どっちにしろ2回ゲル精製しないとならないんだから、一回、フラグメント精製が増えたところでたいして手間はかわらないでしょう。 省略するなら、PCR後にゲル切り出し精製して制限酵素消化後の精製をスキップする。

(無題) 削除/引用 No.9037-7 - 2020/07/27 (月) 15:04:59 - おおお ありがとうございます。 実験の流れで １．PCR ↓(精製) ２．制限酵素処理 ↓(泳動・ゲル切出・精製) ３．ライゲーション （泳動・ゲル切出・精製） とゲル切出・精製を繰り返すことになるので、そこをどうにか減らせないだろうかと考えました。 やはり、無理はせず、素直に精製を行ったほうがいいようですね。

(無題) 削除/引用 No.9037-5 - 2020/07/27 (月) 11:23:10 - G25 ゲル切り出しのカラムは、フラグメント精製にも対応しているもんです（つまり泳動せずに反応液を直接精製する）。下手なことするよりよっぽど簡単じゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.9037-4 - 2020/07/27 (月) 10:35:18 - noname クローニングに使うのかそれ以外の何かに使うのかわかりませんが、 変な手を考えるよりPCR産物を精製する方が早いと思いますよ。 その方法が妥当な方法か検証する必要もありますし。 既存の方法で確実に１ステップずつ進めるのが遠回りなようで近道です。

(無題) 削除/引用 No.9037-3 - 2020/07/27 (月) 10:17:57 - 真琴 AAさんがおっしゃるように、精製するんでしょうね。 フェノクロエタ沈、カラム精製、磁気ビーズ精製、ゲル切り出し、色々あります。 反応bufferも変えないと、EcoRIで切れにくいし。

(無題) 削除/引用 No.9037-2 - 2020/07/27 (月) 09:49:51 - AA PCRミックスをボルテクスすると全くかからなくなりますけど、 あれが本当に完全に失活しているかと言われるとわかりませんね。。 性質上熱には強いので、やるとしたらあとは凍結融解を繰り返すくらいでしょうか。 面倒なので精製したほうが早そうです・・・ PCR後にするのが面倒なら、制限酵素反応後にゲルの切り出しをすれば良いかと思います。

PCRのDNAポリメラーゼを失活することはできますか？ 削除/引用 No.9037-1 - 2020/07/26 (日) 23:17:01 - いいい お世話になっております。PCRで増幅したDNAをその後の工程で制限酵素処理をしたいと思っています。 PCR産物を制限酵素処理する場合、やはりいったん精製してから行った方がいいでしょうか？ 精製せずに、DNAポリメラーゼを失活する方法はありませんでしょうか？ 使用する制限酵素はEcoR1ですので反応温度は37℃ですが、最終ステップでEcoR1の失活が70℃30分ですので、ここでDNAポリメラーゼが残存したままだと平滑末端ができてしまいそうだと懸念しています。

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