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ウエスタンブロットのImageJを用いたバンド定量できない トピック削除
No.9031-TOPIC - 2020/07/20 (月) 20:48:49 - いむ
お世話になります。ImageJを使用してウエスタンブロットのバンド定量を行いたいです。目的バンドのみを囲みたいのですが、”are the lanes really horizontal?”と出てきて、高さが横幅の2倍ないとできないみたいなことが書いてます。横長に囲むことは可能でしょうか？
よろしくお願いいたします。
　
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No.9031-6 - 2020/07/20 (月) 23:03:51 - toto
確認ですが、定量では、ImageJのAnalyzeメニュー＞Gels＞Select First Lane のやり方で最初のレーンを決めて、という方法を使われてますよね？日本語の
https://seesaawiki.jp/w/imagej/d/ImageJ%a5%de%a5%cb%a5%e5%a5%a2%a5%eb%a1%a7Analyze%a1%ca%b2%f2%c0%cf%a1%cb%a5%e1%a5%cb%a5%e5%a1%bc
の下の方のGelsサブメニュのところに詳しく書いてある、ImageJ独特のやり方です。もともとImageJはこの辺からはじまってます。

blotで得たい情報はバンドの絶対量ではなくて、他のレーンとの相対値なので、ノンスペが近くにあってもそこでの線の引き方を一定にすれば、割と正確なレーン同士のバンドの比較ができます。

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No.9031-5 - 2020/07/20 (月) 22:19:06 - いむ
おお様
ありがとうございます。
私の分野の文献を探ってみても、imagejで解析したしか書いて無く、具体的な方法や引用文献もないため困っておりました。ご教示頂いた方法論など勉強してみます。

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No.9031-4 - 2020/07/20 (月) 22:01:31 - おお
それは状況次第です。どちらが正しいとは一概に言えません。確かに近くにバンドがあるときはそのため下駄を履く可能性はあります。なので谷になっている最小値あたりを結ぶのがそういう状況ではよりもっともらしい用に思えます(ただしいつもそれで正しいとまでは言い切れない。)。また縦に引くとバックグランドは差し引いてないだろうというのは確かですが、ピークのIntensityによりけりだと思います。納得できるように工夫するなら、一つだけでも半分量のサンプルなどを用意して、どのように引けば定量した数字が半分になるか見定めてそれに従って全部に適応すると恣意的になりにくいかもしれません。詳しくはクロマトグラフィーなどのピーク定量などの方法論を勉強してください。
もう一つできそうなことは、サンプルが載ってないLaneかメンブレンのエリアでLaneを設定して同じエリアを縦に線を書き、その数値をバックグランドにするか。もしあるならKOサンプルを使ってバックグランド設定をするか（そうすると近くのバックグランドのバンドによる影響を差し引くことが理論上できます）。

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No.9031-3 - 2020/07/20 (月) 21:39:46 - いむ
ご回答ありがとうございます。
目的バンドの近くにノンスぺがありますが、目的バンドとノンスぺを含んだ縦長のレーンでlane plotし、目的バンドのピーク面積を測定することができました。もう1つお聞きしたいのですが、lane plotでバンドは線で山みたいになり、底に線を引いて山を閉じ内側の面積を出しました。線は山の左右の一番低くなった点を横向き結んだ線です。ここで疑問があるのですが、山の左右の低い点を立て向きに線を引き面積を出した場合はバックグラウンドを差し引いてないという事でしょうか？
わかりづらくすいません。どうぞよろしくお願いいたします。

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No.9031-2 - 2020/07/20 (月) 21:19:40 - おお
縦長にして、必要な（バンドの）箇所を囲えばいいのではないでしょうか。たとえメンブレンを切っていて、メンブレンのあるエリアからはみ出して縦長のレーンを設定していたとしても、それは可能だと思います。あるいはスロットブロットのように必要部分を囲ってそのエリアのデンシティーを測ればいいと思いますけど。

ウエスタンブロットのImageJを用いたバンド定量できない 削除/引用
No.9031-1 - 2020/07/20 (月) 20:48:49 - いむ
お世話になります。ImageJを使用してウエスタンブロットのバンド定量を行いたいです。目的バンドのみを囲みたいのですが、”are the lanes really horizontal?”と出てきて、高さが横幅の2倍ないとできないみたいなことが書いてます。横長に囲むことは可能でしょうか？
よろしくお願いいたします。
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