全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9029-11 - 2020/08/03 (月) 11:50:33 - おお >[Re:10] お願いします。さんは書きました : > おお様、toto様 > > この度はコメントをいただきまして、有難うございます。 > > 糖鎖解析の方法論はtoto様の御察しの通りMALDI-TOF MSになります。 > 質量分析も初めてで、糖鎖も門外漢のため、私自身非常に頼りなくここで質問をさせていただきました。 解析している論文をいくらか読めば早かったんじゃないですか？普通読むでしょう。。。 > > toto様、ありがとうございます。 > なるほど、クロロホルムーメタノール沈殿で行うというのは考えが及びませんでした。 > また、TCAを使うでもなく、クロロホルムーメタノールで行えば中性なペレットが出来上がるというのはまさにその通りですね。 > > プロトコルを発見したので、 てか最初にプロトコールが書いてあるリンク貼っておいたでしょう。。。

(無題) 削除/引用 No.9029-10 - 2020/08/03 (月) 10:58:05 - お願いします。 おお様、toto様 この度はコメントをいただきまして、有難うございます。 糖鎖解析の方法論はtoto様の御察しの通りMALDI-TOF MSになります。 質量分析も初めてで、糖鎖も門外漢のため、私自身非常に頼りなくここで質問をさせていただきました。 おお様のおっしゃられるように、まずはどこに外注するのかを決め、調整法にはそこに準じた方法であるべきですね。 ありがとうございました。 toto様、ありがとうございます。 なるほど、クロロホルムーメタノール沈殿で行うというのは考えが及びませんでした。 また、TCAを使うでもなく、クロロホルムーメタノールで行えば中性なペレットが出来上がるというのはまさにその通りですね。 プロトコルを発見したので、まずは外注する会社を決め、指示に従い、クロメタペレットでもいいのであればそのまま送ろうと思います。 クロメタ沈殿なら塩も界面活性剤も除けますもんね...ありがとうございます。 救われました。100ug分のペレットを確保するために150 ug分ほどをクロメタ沈殿させてみます。 おお様、toto様、この度はありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9029-9 - 2020/08/03 (月) 09:48:13 - toto MALDI TOF MSですよね。どこまでやってもらうかですが、この文からすると、クロロホルムーメタノール沈殿した沈殿物をそのまま送るのが一番良いような感じはします。沈殿物を溶かすにはたとえばごく少量の100％TFAをつかうと溶けますが、そのあとで糖鎖を外さないといけないので、むしろなにもしないで中性の沈殿のまま送った方がよさそうです。溶液で送れとはいわれてないので。おおさんのいわれるように詳しく聞いた方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.9029-8 - 2020/08/03 (月) 02:27:04 - おお 糖鎖解析ということに関しては経験も方法論の検討の経験がありませんので、依頼先が決まったらそこと相談してください。具体的な標準的な方法論なのかもしれませんし、解析している人の経験なのかもしれませんし。 確かに水に置換というのは少し不安ではあります。アグルとかも気になりますし。糖鎖解析の先方の方法論は聞いてますか？LCでイオン交換など使うとかなら塩は低いほうがいいでしょうけど必ず０である必要はありませんし、バファーもある程度入っていてもいいかもしれません。またバッファーもTrisがだめとかPhosphateがだめとか色々あるかもしれません。 何も断言できることはありません。

(無題) 削除/引用 No.9029-7 - 2020/08/02 (日) 09:55:12 - お願いします。 大変恐縮なのですが、もう一度あげさせてください。 共同研究先への糖鎖解析を依頼したのですが、そこでは塩と界面活性剤を除いた組換えタンパク質を100ug送ってくださいと言われました。ただ、このコロナ渦でデータを得るには数ヶ月かかりそうです。そこで別のラボを探していますが、サンプルはあらかじめ作っておこうと今組み替えタンパク質を作っています。 塩を除く方法として、おお先生から御指南いただいた限外膜を使ってバッファー交換しようと思います。 質問は水に置換するか、それともTrisなどの緩衝液に置換するかを悩んでいます。 おお様がもしもう一度みていただくチャンスがありましたら、どうか御指南いただけたら幸いに存じます。 どうか、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.9029-6 - 2020/07/24 (金) 09:45:56 - お願いします。 あzsxdcfvgbhんmjk様 確かにそうすべきでした。 あzsxdcfvgbhんmjk様の言われたようなことを想定していたのだと思います。 引き続き、アドバイスをいただけるようでしたらよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.9029-5 - 2020/07/24 (金) 02:03:28 - あzsxdcfvgbhんmjk、 私ならばてか普通に考えて折り返しそうですかではそちら（共同研究先）では普段どのようにしているのですか教えてくれませんかと聞くと思うのですがいやいやそれは教えられませんから自分で考えてくださいねと言われたのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9029-4 - 2020/07/23 (木) 08:08:52 - お願いします。 すみません、トピックを立てさせていただいた者です。 0.5 mlのアミコンフィルターチューブがありましたので、これを用いて組換えタンパク質 in PBSから塩を除こうと思っています。ただ、透析と異なり、どれだけ水を加えては遠心、という操作を繰り返せば良いのか検討もつきません。 目的は組換えタンパク質の糖鎖解析になるので、塩が含まれていては良くないと言われています、 10倍、100倍程度まで希釈をしたらそれで良いのでしょうか？ 質量分析に塩が与える影響に関して、どの程度の塩の残存が許容されるかご存知でしたらご教授いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9029-3 - 2020/07/19 (日) 13:56:03 - お願いします。 おお先生 この度は大変詳しく調製法をお教えいただき、ありがとうございます。 とても感動しています。また、返信が遅れてしまい、大変申し訳ありませんでした。 透析かアミコンチューブでの限外ろ過膜かと考えていましたが、それ以外の方法があるとは考えが及びませんでした。 実は私はタンパク質の扱いは恥ずかしながら初心者なもので、PBSでなく、水に置換しても大丈夫なのか（構造がおかしくなったり等）という点で疑問でした。ただ、おお先生がおっしゃられるようにたとえ変性しても目的は達成できることに気づきましたので、まず簡便なアミコンフィルターでバッファー置換、濃縮をしてみようと思います。 この度はありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9029-2 - 2020/07/18 (土) 06:04:48 - おお 限外ろ過膜を使って遠心して行くのが単純だと思います。抗体はよく１００kDaの限外濾過膜で精製されたりします。１００kDaでなくとも塩は除けますけど。 おそらく変性などしても構わないだろうと思いますので、有機溶媒や尿素が使えるかもしれません。 尿素の方はプロテインAビーズに吸着させておいて水で洗６M尿素で溶出する方法です。一つ確認をしておいてほしいのは塩濃度が低いとイオン相互作用をビーズとする可能性があります。溶出できるかプレリミナリーな結果を持っていたほうが安全です。 おそらく変性などしても構わないだろうと思いますので、有機溶媒を加えて沈殿させペレットの状態で送るてもあるかもしれません。ただし有機溶媒はNaClをほとんど溶かさないので、色々バリエーションがある中で塩が抜けそうな方法論を選択する必要があると思います。アセトンを使う方法は有名ですが、塩との相性はかなり悪いので（ただし１００％の場合）。エタノールを使う方法がベターでしょう。DNAを沈殿させるとき１５０mMぐらいのNaCl存在下で７０％ぐらいのエタノール濃度にして塩を沈殿させずにDNAを沈殿させる方法があるので。 エタノールを使った沈殿方法は５０から９０％になるようにエタノールを加え遠心して蛋白をペレットにして、場合によっては９０から１００％のエタノールでWashすることもあります。エタノールは１００％で１０mMぐらいのNaClを溶解するようなので、９０％から９５％でWashをすればいいかと思います。 メタノールクロロフォルム法も使えそうな気がします。 ただし回収量は状況、蛋白によって回収量はばらつきますし、塩の残留については実際のデーターは持ってません。 いずれにせよ先方と相談してください。 有機溶媒による蛋白沈殿については以下が参考になるかと思います。 http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/ProteinPrecipitation.html http://cshprotocols.cshlp.org.turing.library.northwestern.edu/content/2006/1/pdb.prot4310

塩とデタージェントのないタンパク質のプレップ 削除/引用 No.9029-1 - 2020/07/18 (土) 02:10:45 - お願いします。 質問お願いします。 共同研究先から、抗体の糖鎖解析のための質量分析には「100ug of the protein free of salt and detergent」が必要ですと伝えられました。私のは組換え抗体なのですが、プロテインAカラムから溶出したものをPBSに置換しています。 これでは塩が入っている、ということになると思うのですが、では今ある材料からどのように塩を除くことができますでしょうか？ 界面活性剤は入ってはいません。 なるべくロスのない、簡便な方法を採用したいです。 恐縮ですが、アドバイスをいただけると幸いです。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---